细胞功能实验那些事∣细胞坏死性凋亡

1. 坏死性凋亡（Necroptosis）

        本期小恒带大家了解细胞的另一种程序性死亡方式—坏死性凋亡，类似于细胞凋亡的受调控过程，但它表现出与坏死相似的形态学特征。坏死性凋亡最初发现是作为凋亡的一种替代形式出现的，它在细胞无法执行凋亡的情况下被激活。与凋亡不同，细胞坏死性凋亡表现为细胞膜的破坏和细胞内容物的释放，这可能导致局部炎症反应。细胞坏死性凋亡的典型特征包括细胞膜的完整性丧失、细胞肿胀、细胞膜破裂以及细胞内容物的外泄。从形态学上来说，细胞坏死性凋亡的表现与经典的细胞坏死类似，但是在机制上，它受到细胞内一系列信号传导分子的调控。

2. 坏死性凋亡的主要机制      

（1）当肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）被TNFα识别激活时，会启动一系列下游信号事件。如果凋亡途径被抑制，RIPK1就会被招募到一个包含FADD（Fas相关死亡结构域）、caspase-8和caspase-10的寡聚复合体中。在caspase-8不存在或活性被抑制时，则RIPK1会进一步招募并磷酸化RIPK3，形成死亡诱导复合体（ripoptosome）。接着，RIPK3会磷酸化MLKL，使得MLKL形成寡聚体并移位至富含磷脂酰肌醇磷酸（PIP）的质膜区域。MLKL寡聚体在细胞膜上形成大孔隙，导致细胞外离子流入、细胞肿胀、膜破裂以及不可控的细胞内容物释放，最终引发坏死性凋亡。

（2）坏死性凋亡还可通过多种途径被激活，其中包括但不限于TNFα、Fas配体、Toll样受体3/4（TLR3/4）的激活。这些信号能够触发RIPK1-RIPK3-MLKL的级联反应，最终导致细胞膜的破损和细胞死亡。

（3）其他调控因子：除了上述的核心成分之外，还有其他分子参与调控坏死性凋亡的进程。例如，Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）在一些情况下与坏死性凋亡相关，特别是在营养应激条件下，它可以通过识别细胞质中的线粒体DNA/RNA来激活RIPK3-MLKL轴，导致坏死性凋亡。

3. 坏死性凋亡的检测方法

（1）细胞形态变化：细胞死亡的形态变化是一个动态变化的过程，因此，需要实时“监控”整个过程才能确认坏死性凋亡的发生。延时视频显微镜能够将单个细胞的形态变化与分子、亚细胞和生化事件相关联，从而检测坏死性凋亡（但此方法成本较高且比较耗费人力）。

（2）抑制和敲除：坏死性凋亡的抑制剂——RIPK1 抑制剂 Necrostatin-1 和 MLKL 抑制剂 Necrosulfonamide 来阻断坏死性凋亡，测定细胞的存活率，反向验证坏死性凋亡的发生。但是抑制剂能在某些细胞中诱导细胞凋亡，在区分坏死性凋亡和凋亡方面不够特异。因此，需要通过敲除关键蛋白（如RIPK3或MLKL阻断坏死性凋亡），补充抑制实验的证据。

（3）关键蛋白质检测：用WB、IHC或流式细胞仪来检测坏死性凋亡途径中的关键蛋白质如RIPK3、RIPK1和MLKL的变化。磷酸化MLKL（Ser358和Thr357）是最常见的检测蛋白，可确认坏死性凋亡是通过RIPK3介导的MLKL激活。此外，RIPK1/ pro-caspase-8 的高比例也说明了环境有利于坏死性凋亡。

参考文献

[1] Yan J, Wan P, Choksi S, Liu ZG. Necroptosis and tumor progression. Trends Cancer. 2022 Jan;8(1):21-27. doi: 10.1016/j.trecan.2021.09.003.