3个月拿下一区SCI！巨噬细胞+细胞衰老联合网药助力中医药研究！
言归正传，今天分享的这篇文献就是由北京中医药大学李晓骄阳团队今年2月发表在该刊上的文章。随着中医药的热度越来越高，研究的学者也越来越多。那么同是中医药研究，本文究竟有何特别之处呢，跟着小薇师姐一起来看看吧！
1.本文基于巨噬细胞+细胞衰老两个国自然大热门为研究内容，以网络药理学为主要方法的思路在中医药研究中比较新颖，是本文的一大亮点。
2.本文揭示了丹酚酸B（SAB）可以通过影响细胞衰老相关的关键分子和信号通路来减轻肺纤维化，这一机制为肺纤维化治疗领域提供了新方向。
3.本文利用网络药理学预测了SAB作用靶点，这种方法的创新应用为中药现代化和精准医疗提供了新思路。
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题目：丹酚酸B通过减弱刺激蛋白1介导的巨噬细胞和肺泡2型细胞衰老预防肺纤维化
期刊：Phytotherapy Research
影响因子：6.1
发表日期：2024年2月
公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20241024
研究背景
特发性肺纤维化（IPF）作为最常见的特发性间质性肺炎，主要是由复杂的病理机制相互作用引起的。有趣的是，IPF常发生于中老年人群，但很少影响年轻人。丹酚酸B (SAB)具有抗氧化、抗炎和抗纤维化生物活性，被认为是一种有前景的肺部疾病治疗药物。然而，SAB对肺细胞衰老和IPF发展的药理作用和机制仍不清楚。
研究思路
本文利用博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化小鼠和不同的肺细胞来研究SAB的抗衰老作用，并通过网络药理学和人类蛋白质图谱数据库解释其潜在机制。
主要结果
1.SAB减轻BLM诱导的小鼠肺损伤和肺纤维化
研究分析了SAB对BLM诱导IPF小鼠模型的治疗作用，分析发现SAB可以显著改善BLM诱导IPF小鼠的肺功能，并且减轻肺泡结构紊乱、炎症细胞浸润、肺泡水肿和肺间隔增厚症状。同时，Masson染色发现BLM诱导的胶原沉积（蓝色纤维）在SAB处理的小鼠中显著减少，HE染色和Masson染色的肺组织切片也显示SAB处理的小鼠的肺纤维化评分降低。这些结果表明了SAB对肺纤维化具有治疗作用（图1）。
研究者进一步对SAB处理的BLM诱导IPF小鼠模型中肺纤维化和炎症过程进行了评估，评估结果表明SAB处理显著降低了肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量（图2a），同时多种纤维化和炎症相关基因的mRNA表达水平也显著降低（图2b-c），包括Col1a1、Acta2、Tgf-b、Tnf-a、IL-6等。而免疫荧光染色结果也表明在SAB处理的IPF小鼠肺组织中，α-SMA、COLLAGEN、IL-6的表达水平显著降低（图2d）。这些结果表明SAB具有抗纤维化和抗炎作用。
图1 SAB可显著减轻BLM诱导IPF小鼠的肺功能和病理损害
图2 SAB可逆转IPF小鼠的肺纤维化和炎症过程
2.SAB抑制AT2细胞EMT的发生
TGF-β在驱动AT2细胞向成纤维细胞分化的过程中起着关键作用，因此为了进一步探究SAB对A549细胞中TGF-β诱导的上皮-间充质转化（EMT）的影响，研究者首先通过CCK8实验确定SAB对A549细胞的活力没有毒性作用（图3a）。随后，通过细胞迁移能力测试发现SAB在TGF-β存在的情况下能够显著抑制A549细胞的迁移能力（图3b）。而免疫荧光染色结果显示SAB处理能够抑制TGF-β诱导的A549细胞中α-SMA蛋白和N-CAD蛋白的表达（图3c-d）。此外，研究者通过qPCR和WB分析进一步发现SAB处理能够显著降低TGF-β诱导A549细胞中FIBRONECTIN、COLLAGEN和α-SMA的mRNA和蛋白水平（图3e-f）。这些结果进一步证明了SAB具有很好的抗纤维化作用。
图3 SAB改善A549细胞中TGF-β刺激的上皮-间充质转化情况
3.SAB在体内和体外均可减少与巨噬细胞和AT2细胞为中心的肺衰老相关的肺纤维化
本研究对衰老的AT2细胞是否会刺激巨噬细胞的流入和炎症细胞因子的产生进行了评估，发现SAB可以显著降低BLM诱导的IPF小鼠肺组织中p21、p53和p16 mRNA的表达（图4a），这一结果也在WB分析中得到验证，但对p53蛋白表达水平在WB中显示无显著变化（图4b）。此外，染色实验结果表明SAB能够显著降低BLM诱导的IPF小鼠肺组织中P16阳性巨噬细胞（P16+/F4/80+）和P21阳性AT2细胞（P21+/SP-C+）的数量（图4c-d）。为了进一步验证SAB对体外逆转BLM诱导的巨噬细胞和AT2细胞衰老的影响，研究者通过SA-β-gal染色检查细胞质SA-β-gal活性，研究结果表明与对照组相比，BLM导致SA-β-Gal+细胞的数量显着增加，而SAB则减少了已发生细胞衰老的阳性蓝色细胞的数量（图5a，d）。同时，研究发现BLM 组中P21+或P16+的比例显著增加，但经SAB处理后迅速减少（图5b,e）。此外，研究者发现与单独BLM处理相比，P16 和 P21 的蛋白水平显着降低（图5c，f）。这些结果表明SAB对于抑制巨噬细胞和AT2细胞的衰老有显著作用。
图4 SAB可减轻IPF小鼠的肺衰老症状
图5 体外实验SAB对衰老巨噬细胞和肺泡II型细胞的治疗作用
4.SAB通过减少巨噬细胞和AT2细胞分泌SASP因子降低HPF激活
研究者收集了从BLM和SAB处理的衰老THP-1和A549细胞的培养基，并与HPF细胞一起孵育24小时，随后的免疫荧光和蛋白质印迹结果显示α-SMA等纤维化相关蛋白表达水平较高（图6a,d）。并且发现经SAB处理后，活化的HPF细胞和典型纤维化标志物显著减少（图6b,e）。此外，对细胞培养基中的蛋白质进行分离和检测的结果显示THP-1细胞培养基中IL-1β和A549细胞培养基中TGF-β水平显著降低（图6c,f）。这些结果表明SAB可以减少以TGF-β衰老巨噬细胞和以AT2细胞为代表的SASP的分泌，发挥抗肺纤维化作用。
图6 SAB通过逆转巨噬细胞和肺泡II型细胞的衰老降低肺成纤维细胞的活化
5.SP1转录因子预计参与SAB诱导的抗衰老作用
为了进一步探究SAB的调控靶点，研究者基于药物靶点与疾病作用的综合关系进行了网络药理学分析，研究在SAB和IPF中共检测到65个重叠的DEG（图7a），随后对65个交叉口目标的PPI网络进行分析发现mTOR、JUN、淀粉样前体蛋白和成纤维细胞生长因子12基因是SAB调节IPF过程的中心基因（图7b,c），并利用Metascape数据库丰富了ECM组织、止血和细胞迁移相关通路（图7d）。TFtarget分析也显示，在TRRUST数据库中许多DEG受到TF的调控（图7e），这些结果表明TF调控网络可能在SAB的效果中发挥重要作用。此外，研究者发现肺纤维化患者的SP1蛋白水平显着高于正常人群（图7f）。
图7 网络药理学分析预测SAB治疗IPF的潜在靶点
6.SAB抑制SP1与P21/P16启动子的结合
研究者在SP1与P21/P16启动子结合是否能影响多种生物过程的研究中发现，IPF小鼠肺组织中SP1蛋白水平和分布略有增加，而不同剂量SAB处理会引起的SP1蛋白水平和分布的下降（图8a,b）。然而在BLM存在的情况下，THP-1和A549细胞中SAB诱导的SP1蛋白水平显著下调（图8c,e），这一结果也在免疫细胞化学分析中得到了证实（图8d,f）。ChIP-qPCR分析结果也显示，在THP-1和A549细胞中，SAB治疗后的SP1启动子的蛋白质与DNA结合显著减少（图8g）。
图8 SAB抑制SP1与P21/P16启动子的结合逆转细胞衰老
文章小结
本文通过体内外实验探究了SAB对肺纤维化的治疗效果，特别是其对巨噬细胞和肺泡2型细胞衰老的影响，并发现SAB能够抑制SP1转录因子与P21和P16基因启动子的结合，进而减少衰老细胞SASP因子释放，减轻肺纤维化症状，为肺纤维化治疗提供了新的分子机制和潜在的治疗策略。本文的内容是不是让你眼前一亮，既有当下的研究热点，又有创新的研究思路！各位研友们看完是不是觉得有很大的复现性呢，已经有想法的朋友们快来小薇师姐吧！当然，也欢迎感兴趣但是没有思路的朋友前来滴滴，这里有专业团队为你提供专属方案设计，个性化数据分析等全方位服务哦~小薇师姐全面助力每一个科研梦想！