项目文章JIPB（IF=9.3）中科院童依平团队揭示小麦叶片衰老调控

叶片衰老是影响籽粒产量和营养品质的重要生理过程。开花后叶片持绿时间（GLD）直接反映叶片衰老过程，在普通小麦中表现出较大的基因型差异；然而到目前为止，关于其根本的基因调控机制仍未可知。

近日，中国科学院遗传发育所童依平团队在Journal of Integrative Plant Biology(JIPB)在线发表了题为“Functional divergences of natural variations of TaNAM‐A1 in controlling leaf senescence during wheat grain filling”的论文。该研究利用酵母杂交、转录组分析等技术表明TaNAM-A1可直接调控参与叶片中生物大分子物质降解途径以及Zn和Fe再分配途径的下游靶基因的表达来影响叶片的衰老，同时还参与穗长和粒径的调节，为不同地理气候条件下小麦叶片功能周期的微调和籽粒产量形成提供了新的思路。

欧易生物对该项目的酵母文库构建和转录组测序提供了支持。

发表期刊：Journal of Integrative Plant Biology(JIPB)

影响因子：9.3

发表日期：2024年4月

涉及欧易的技术服务：酵母文库构建、转录组测序

1. TaNAM-A1是叶片衰老的正调节因子，同时参与穗状伸长和粒径调节

首先，作者通过数量性状位点(Quantitative trait loci, QTLs)分析和图位克隆法确定TaNAM-A1为qGLD-6A的候选基因，为了验证TaNAM-A1在调控叶片衰老中的作用，作者构建了小麦TaNAM-A1a（命名为KN-NAMa-OE）和TaNAM-A1d（命名为FD-NAMd-OE）过表达系。结果发现，在籽粒灌浆期的叶片中，转基因株系的旗叶中TaNAM-A1的表达显著增加，导致早期衰老显著（图1a-f）。同时作者构建了178A的全长TaNAM-A1d，包括2085 bp的天然启动子和 1557 bp编码区（命名为FD-NAMd-COM）发现，与对照相比，两个独立的FD-NAMd-COM转基因系都显示出1-2天的延迟衰老，TaNAM-A1的表达水平相似（图1d-f）。

图1 使用转基因系和突变体验证TaNAM-A1作为qGLD-6A的主要基因

此外作者在K1107和K481中发现了TtNAM-A1的两个错义突变，其中K1107在叶片衰老中表现出1-2天的轻微延迟（图1h）；K481在2-4天内表现出明显的叶片衰老延迟（图1g、h），这两突变在mRNA表达水平上并未发生显著变化（图1I）。综合所有结果，TaNAM-A1是qGLD-6A的致病基因(causal gene)，仅在繁殖阶段作为叶片衰老的正调节因子发挥作用。

之后作者发现KN-NAMa-OE和FD-NAMd-OE转基因株系的穗长比对照分别长约25%和17%（图2b、c和e），籽粒长度均显著增加，但是籽粒宽度和千粒重(TGW)均大幅减少（图2d，3g-i）；FD-NAMd-OE转基因株系每个穗产生的籽粒明显更多，在KN-NAMa-OE转基因品系中没有观察到类似的效果（图2f）；虽然FD-NAMd-COM中TaNAM-A1d的表达对穗长和粒径的影响较小，但每个穗产生的籽粒略多（图 2c、2d-i），因此，FD-NAMd-COM的每穗粒产量（GYS）比野生型（图2j）高出约20%，并且可能比其他转基因株系具有高产潜力。总而言之TaNAM-A1还具有调节穗长和粒径的功能。

图2 田间条件下TaNAM-A1转基因OE株系穗长和籽粒相关性状

2.TaNAM-A1在叶片衰老过程中调控参与生物大分子降解和 Fe/Zn 再分配的基因表达

为揭示TaNAM-A1对叶片衰老的调控机制，对开花后12天和21天时KN-NAMa-OE1阳性系和阴性对照叶片进行转录组分析发现，在1315个关键差异表达基因(DEGs)中，696个上调基因在生物大分子代谢通路方面表现出显著富集，593个下调基因在光合作用相关途径方面表现出显著富集；通过qRT-PCR分析进一步证实，TaPAO-4B、TaBFN1-2A、TaHMA2like-7A、TaIDS3-7A和TaATL13-2B在TaNAM-A1a OE株系中的表达显著上调，但在TILING突变体中表达显著下调（图3a-e）；在TILLING突变体中未检测到TaIDS3-7A的表达（图3e）；TaNAC-S-7A在TaNAM-A1a OE系中显著下调，而在TILLING突变体中显著上调（图3f）。

图3 三种TaNAM-A1单倍型的蛋白质激活启动子

接下来，通过体外下拉试验和电泳迁移率位移试验（EMSA）证明，TaNAM‐A1a, TaNAM‐A1c, and TaNAM‐A1d均能直接与 TaPAO-4B、TaBFN1-2A、TaHMA2like-7A、TaIDS3-7A 和 TaNAC-S-7A 的启动子结合（图3g和h），表明TaNAM-A1的序列变异单倍型不会影响其识别靶标核心基序及其结合活性。然后作者进行了双荧光素酶转录活性测定，结果表明3种蛋白均显著激活TaPAO-4B、TaBFN1-2A、TaHMA2like-7A和TaIDS3-7A的表达，TaNAM-A1a的激活活性最高，TaNAM-A1d最低（图3k-n）。另外这三种蛋白都显著抑制了TaNAC-S-7A的表达，TaNAM-A1a的抑制作用最强，TaNAM-A1d最弱（图3j）。这些结果表明，TaNAM-A1的序列变异导致下游靶基因调控功能差异。

3. TaNAC016-3A是一种衰老诱导的NAC转录因子，是TaNAM-A1的下游靶标，与 TaNAM-A1 蛋白相互作用

最后，作者进行了酵母双杂交筛选来鉴定TaNAM-A1的相互作用蛋白，得到编码NAC转录因子的基因TraesCS3A02G078400，命名为TaNAC016-3A。接下来的GST pull-down测定、双分子荧光互补（BiFC）测定和荧光素酶互补成像（LCI）测定证实了所有三种TaNAM-A1蛋白在体外和体内与TaNAC016-3A相互作用（图4a-b），表明基因编码序列的两种突变不影响TaNAM-A1蛋白与TaNAC016-3A的二聚化。

图4 TaNAC016-3A与TaNAM-A1的相互作用

随着旗叶在籽粒灌浆期老化，TaNAM-A1的表达量在开始时逐渐升高，在18天时达到峰值水平，此后下降；而TaNAC016-3A的表达在18天后的籽粒灌浆后期急剧升高（图4c）；TaNAC016-3A在KN-NAMa-OE系中显着上调，在TILLING突变体中下调（图4d）。EMSA试验证实TaNAM-A1直接与TaNAC016-3A启动子结合（图3h），表明TaNAC016-3A是TaNAM-A1的下游靶标，在籽粒灌浆阶段由衰老诱导表达。

EMSA验证了TaNAC016-3A以及三种TaNAM-A1蛋白可以直接与TaPAO-4B启动子结合（图4e）；双荧光素酶转录活性(D-LUC)测定结果表明，TaNAC016-3A对TaPAO-4B的反式激活作用要强于三个TaNAM-１基因，共表达TaNAC016-3A与TaNAM-A1会进一步增强对TaPAO-4B启动子的反式激活活性（图4f-i）。总体而言，这些结果表明，尽管三种TaNAM-A1蛋白都可以与TaNAC016-3A相互作用，但它们与TaNAC016-3A的相互作用对激活下游基因的活性有不同影响。

图5 TaNAM-A1调控叶片衰老的工作模式图

基于上述研究，作者提出TaNAM-A1调控叶片衰老的调控机制（图5），开花前，TaNAM-A1的表达和功能受到TaARF15-A1或其他未知机制的抑制，使其不能在开花前启动叶片衰老。开花后，来自未知因素的抑制被消除。高表达的TaNAM-A1蛋白与下游靶基因启动子结合，激活SAGs和参与微量营养素再动员的基因的表达，但抑制TaNAC-S-7A的表达。所有这些变化都触发了叶子衰老的开始。TaNAM-A1 激活 TaNAC016-3A 表达。随后，TaNAC016-3A与TaNAM-A1相互作用，激活SAGs的表达，可能在籽粒灌浆后期广泛承担促进衰老的作用。

童依平研究员为该论文通讯作者，课题组博士后周龙溪为第一作者。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员、李义文研究员、李云海研究员以及山东农业大学付道林教授，山东省农业科学院李根英研究员、中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿研究员等为本研究提供了宝贵的帮助和指导。本研究得到了中科院先导专项和国家自然基金的资助。

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