浙江大学包劲松利用蛋白多组学揭示籼稻突变体高抗性淀粉形成机制

作者：迈维代谢发布时间：2024-09-23

可溶性淀粉合成酶IIIa (Soluble starch synthase IIIa, )是水稻支链淀粉生物合成的关键酶，缺乏会导致抗性淀粉含量高，这对人体健康是有益的。但是目前对籼稻突变体种子的代谢差异和碳重新分配知之甚少。2024年9月，浙江大学农学院包劲松团队在Carbohydrate Polymers期刊发表了题为“Multi-omics analyses reveal mechanism for high resistant starch formation in an indica rice mutant”的文章。通过多组学分析发现失活通过下调蔗糖合酶、细胞壁蔗糖转化酶1、果糖激酶和己糖激酶来触发碳的重分配，促进可溶性糖的积累。迈维代谢提供了初生代谢组、转录组和4D-DIA蛋白组的检测分析服务。

1.活性的丧失降低了贮藏蛋白的合成、减少了水稻胚乳中淀粉的积累、促进籽粒中碳的重新分配、促使可溶性糖、游离氨基酸、脂质含量的积累以及抗性淀粉的增加。

2.初生代谢组分析鉴定出109个在胚乳中显著变化的代谢物，主要参与核苷酸代谢和柠檬酸循环。

3.WT和胚乳的转录组共鉴定出1581个差异基因和118个转录因子(TF)，涵盖35个TF家族，差异基因主要参与淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及碳代谢。

4.4D-DIA蛋白组共鉴定出7719个可定量的蛋白质，438个差异表达蛋白，这些蛋白与翻译后修饰、碳水化合物和脂质转运和代谢以及能量产生和转化密切相关。

5.联合分析表明突变介导mRNA或蛋白质水平上的多种重要酶的变化，导致碳水化合物、脂质和氨基酸含量发生广泛变化。

1.活性的丧失影响了储备物质的含量

为研究突变对精米中主要储备物质的影响，测定了WT和的总淀粉、还原糖、粗蛋白质和粗脂肪含量。如图1所示，的主要储备物质与WT存在显著差异。与WT相比，预计的总淀粉含量下降了3.4%(图1A)，表明突变对淀粉合成产生了强烈影响。相反，其他储备物质的含量明显增加。种子的还原糖总量是WT种子的1.3倍(图1B)。粗蛋白质含量提高了4.1%(图1C)。的粗脂肪含量高出1.5倍以上(图1D)，这表明的缺乏明显促进了脂肪的积累。的AAC（表观直链淀粉含量，34.0%)显著高于WT(25.7%)(图1E)。的RS（抗性淀粉，3.15%）比WT高1.6倍(图1F)。此外，与WT相比，的种子重量略低，但差异不显著(图1G)。

图1 WT和的主要储备物质含量

2.可溶性糖、游离氨基酸、脂肪酸和淀粉磷脂含量较高

为了进一步确定碳氮代谢方面的具体代谢差异，研究者对可溶性糖、游离氨基酸、脂肪酸和淀粉磷脂进行了测定。如图2所示，WT和的总体组成相似，但代谢含量差异较大。中所有糖产物的积累都显著增加(图2A)，蔗糖增加了1.8倍，半乳糖增加了2.8倍，葡萄糖增加了1.9倍，果糖增加了1.2倍，棉子糖增加了1.4倍。同样的，游离氨基酸含量也同步增加(图2B)，其中以胱氨酸(18.2倍)和γ-氨基丁酸(10.6倍)的变化最为显著。此外，结果显示除顺式-8,11,14-二十碳三烯酸(C20:3)外，所有鉴定的游离脂肪酸在中的积累量均高于WT(图2C)，前三个脂肪酸分别为棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)，占总浓度的75%以上，分别增加了25.0%、37.2%和31.4%。淀粉磷脂含量检测结果表明，中所有溶血磷脂酰胆碱(LPCs)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPEs)均增加(图2D)。

综上所述，这些观察结果与粗含量分析结果一致(图1B-D)，表明突变影响了水稻种子的碳、氮和脂代谢。

图2种子中糖、游离氨基酸、游离脂肪酸和淀粉磷脂含量的变化

3.胚乳中初级代谢物质的变化

为了进一步揭示发育中胚乳的代谢差异，在15 DAF时对WT和进行了初生代谢组学分析。从所有样本中共鉴定出717种具有明显注释的初级代谢物(图3A)。进一步通过p值< 0.05和FC≥1.2或≤0.7筛选差异积累代谢物(DAMs)，鉴定出109个在胚乳中显著变化的代谢物(图3B)。同时，对DAMs进行了KEGG富集分析，KEGG分析结果显示，DAMs主要参与核苷酸代谢和柠檬酸循环(TCA循环)(图3C)。

这些DAMs主要包括氨基酸及其衍生物(33个，30.8%)、脂质(30个，28.0%)、有机酸(17个，15.9%)、糖类(12个，11.2%)、核苷酸及其衍生物(12个，11.2%)和维生素(5个，4.7%)(图3D)。中有18个下调，15个上调的氨基酸及其衍生物，其中L-胱氨酸是唯一一个显著变化的氨基酸(增加了2.42倍)。至于脂质，游离脂肪酸、甘油酯(主要上调)、LPCs和LPEs(主要下调)也发生了显著变化。此外，饱和脂质大量上调，而不饱和脂质大量下调。大部分参与碳代谢的有机酸下调，包括柠檬酸(减少0.60倍)、异柠檬酸(减少0.64倍)和磷酸烯醇丙酮酸(减少0.67倍)。同样，与嘌呤和嘧啶代谢相关的大多数核苷酸和衍生物也被下调，如次黄嘌呤(下降0.70倍)、尿嘧啶(下降0.65倍)和AMP(下降0.63倍)。

这些结果表明，的失活可能破坏了细胞生长和生存所必需的几个关键代谢途径。相反，淀粉代谢异常导致其他碳水化合物(糖类)的大量增加，其中甘露糖增加了3.37倍。总的来说，突变对水稻胚乳的初级代谢组有很大的影响。

图3 WT和的主要代谢物和差异物质的分析

4.突变触发转录的重编程

为了测试胚乳中代谢物的变化是否与基因表达和蛋白质组成的改变有关，研究者首先比较了WT和胚乳的转录组并进行差异表达分析(p值< 0.05，FC≥2或≤0.5)。差异表达基因(DEGs)的火山图和差异热图显示，1581个差异基因中34.22%表达上调，65.78%表达下调。

为了进一步了解DEGs的生物学功能，随后进行了KEGG途径富集和KOG(真核生物全基因组的同源群)注释。KEGG分析结果显示，DEGs主要参与淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及碳代谢(图4A)。同样，KOG注释结果也显示，DEGs与碳水化合物、氨基酸和脂质转运和代谢密切相关(图4B)。此外，共鉴定出118个转录因子(TF)，涵盖35个TF家族(图4C)。总的来说，AP2/ERF-ERF(13.11%)、MYB(12.10%)、NAC(11.9%)和bHLH(11.9%)是相对较大的TF家族，这意味着这些显著改变的TF在应对缺陷中发挥了重要作用。

图4 WT与差异基因的表达分析

为了验证转录组结果的准确性，研究者选择了20个变化最显著且与碳水化合物代谢相关的基因进行qRT-PCR检测。结果表明，所有20个基因的表达与转录组的结果一致(图5)。

图5 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证RNA-Seq结果

5.突变对胚乳蛋白质组有较大影响

为了进一步了解活性丧失对蛋白质水平的影响，研究者对上述相同的WT和胚乳进行了4D-DIA蛋白质组学分析。共鉴定出7719个可定量的蛋白质。通过p值< 0.05，FC≥1.5或≤0.67筛选差异表达的蛋白，共获得438个差异表达蛋白(DEPs)，其中中有182个上调的蛋白，256个下调的蛋白。

GO富集分析显示，差异的蛋白质主要富集在“碳水化合物代谢过程”、“细胞碳水化合物代谢过程”和“多糖代谢过程” (图6A)。同时，“核糖体大亚基生物发生”、“核糖体前体”、“LSU-rRNA成熟”、“rRNA加工”、“rRNA代谢过程”等途径也显著富集，其中大部分蛋白(58/60)下调，表明突变可能影响核糖体功能和翻译效率。此外，KOG富集分析表明，DEPs与翻译后修饰、碳水化合物和脂质转运和代谢以及能量产生和转化密切相关(图6B)。

WoLF PSORT预测的亚细胞定位显示，大量DEPs位于质体(185个，42 %)和细胞质(75个，17 %)中(图6C)，这意味着与物质代谢密切相关。基于代谢途径，选择34个参与碳水化合物、氨基酸、脂肪酸和碳代谢的DEPs，生成共表达网络，使用Cytoscape进行可视化，寻找它们之间潜在的蛋白-蛋白相互作用(图6D)。其中编码糖基转移酶的蛋白(Q69LA5)连接度最高，与模块中其他蛋白的关联数量最多。此外，预测有4种DEPs与SSIIIa相互作用，包括SSI、AGPL3 (AGPase大亚基3)、AMY1.2 (α-淀粉酶同工酶3A)和α-淀粉酶前体(A0A0P0V7G8)。

图6 WT与的差异表达蛋白分析

6.转录组学和蛋白质组学分析受活性丧失影响的主要代谢途径

突变影响水稻胚乳的转录组和蛋白质组(图4和图6)。且相关性分析显示转录组和蛋白质组中mRNA和蛋白质水平变化趋势不一致，这可能是因为转录后、翻译、翻译后修饰和蛋白质折叠导致的。

随后结合转录和翻译水平绘制了活性缺失对WT和胚乳中代谢途径影响的示意图。如图7所示，描述了胚乳中简化的代谢途径以及与碳和氨基酸代谢相关的相应酶(异构体)的mRNA和蛋白质丰度。在mRNA和蛋白水平上下调的表达可直接降低支链淀粉长链的积累，相反，直链淀粉和支链淀粉短链的生物合成可能通过上调的AGPL3和SSI亚型的蛋白水平和增加的葡萄糖-1P而被激活。同时，两种淀粉酶(α-AMY和β-AMY)在中表达上调，这可能导致淀粉降解能力增强，导致淀粉含量降低。

与淀粉相反，其他碳水化合物(糖类)在种子中大量积累，包括半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖和葡萄糖。它们可能受到与半乳糖和蔗糖代谢有关的基因(等)和蛋白质(UGE、galA、SPP等)的调控。上调的基因和下调的基因可能会减少糖酵解的碳流量，导致糖酵解的中间产物如甘油- 3-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸的积累减少。此外，和基因的表达降低可能会减慢磷酸烯醇丙酮酸和草酰乙酸的相互转化速度。

TCA循环是碳水化合物、脂质和氨基酸的最终代谢途径，它是连接这三种主要营养物质代谢的枢纽。随着基因的下调，TCA循环的两个关键中间产物柠檬酸盐和异柠檬酸盐显著降低。相比之下，SDHC在蛋白质水平上调，这可能促进了天冬氨酸家族氨基酸(草酰乙酸衍生)的合成，尽管草酰乙酸并没有作为显著上调的代谢物出现。同样，(2S)-α-乙酰乳酸积累的增加可能导致亮氨酸和缬氨酸(丙酮酸衍生氨基酸)含量的增加。乙酰-CoA(糖酵解的中间产物)也用于丙二酰CoA的合成和随后的脂肪酸生物合成，虽然在中和两个基因下调，但胚乳中表达水平最高的一个基因显著上调，这可能是成熟种子中几乎所有长链脂肪酸都增加的原因之一。与WT相比，中ω-单加氧酶和基因表达水平较低，导致脂肪酸分解下降。初生代谢组学分析显示，中大部分甘油酯上调，而LPCs和LPEs下调，这可能与PISD蛋白水平降低有关。

总之，突变导致碳水化合物、脂质和氨基酸含量的广泛变化，这是由mRNA或蛋白质水平上的多种重要酶改变引起的。