在肝脏类器官中引入人工血管产生hiPSC-BD作为先天性胆道疾病模型

本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社

胎儿发育过程中，血管和上皮组织间的相互作用，对器官形成至关重要。日本东京大学一项新的研究开发了一种新的3D共培养方法，模拟肝上皮与血管相互作用建立了功能性人来源3D胆管，为人类先天性胆道疾病提供了可行的离体模型。

文章介绍

• 题目：Generation of human iPSC-derived 3D bile duct within liver organoid by incorporating human iPSC-derived blood vessel

• 杂志：Nature Communications

• 影响因子：14.3

• 日期：2024年8月

#1

研究背景

Background

专门围绕肝脏大血管（BV）发育的胆管（BD）负责将干细胞分泌的胆汁排入肠道中。胆管细胞是肝内胆管疾病（IHBD）的上皮成分，由成肝细胞（双能胎肝祖细胞）分化而来，具有分泌功能。IHBD的结构功能障碍阻止胆汁排泄并导致“胆汁淤积”，导致严重的肝组织损伤。已经从人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肝祖细胞、间充质细胞（MC）和内皮细胞（EC）开发了肝类器官，但缺乏胆汁引流系统。hiPSC类器官技术已用于开发由具有分泌功能的胆管细胞组成的IHBD样囊性结构。然而，考虑到BV-BD相互作用对于IHBD的发展至关重要，开发一种在BV周围离体重建人类BD的方法对于了解人类新生儿胆道结构异常形成的病因至关重要。因此，本研究从hiPSC诱导imSMC。通过将含有来自 hiPSC 的 imSMCs 和 ECs 的人工 BV 结合在一起，成功地在 hiPSC-BV 结合肝脏器官（BVLO）中生成了 BD 结构。考虑到调节BV-BD相互作用的分子途径在BVLO中得到模拟，为人类先天性胆道疾病提供了可行的离体模型。

#2

研究思路

Methods

从hiPSC诱导imSMC，通过将含有imSMC和EC的人工BV结合，在hiPSC-BV加入的肝类器官（BVLO）中产生BD结构。

#3

研究结果

Results

1、门静脉血管平滑肌细胞与胆管细胞早期分化的相关性和含有hiPSC-血管的未成熟SMC（hiPSC-BV）的产生（图1）

平滑肌蛋白22（SM22）和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）分别作为血管SMC的早期和晚期标志物。因此对胚胎第15.5天（E15.5）的小鼠肝脏进行免疫染色，结果显示αSMA的强表达主要在腹腔区，在外周区明显微弱。对妊娠第15周（GW15）的人胎肝切片的免疫染色表明，在SM22+αSMAlow SMC旁边出现了无清晰管腔的SOX9+和CK19+导管板，而那些与SM22+αSMAhigh SMC相邻的导管板与管腔形成有关。从人GW 9 -12胎肝单细胞转录组数据中提取了以Pdgf受体β、波形蛋白、结蛋白和胶原1a1的表达为特征的间充质细胞群组，并进一步鉴定血管SMC相关基因表达群组，其特征在于表达转凝胶蛋白（TAGLN）（编码SM22的基因）、肌动蛋白α 2（ACTA 2）（编码αSMA的基因）和JAG1。与点图一致，αSMA+细胞存在于特征图上的所有群组中，而大多数SM22+和JAG1+细胞位于群组1中。为了评估这些基因的共表达情况，在特征图中突出显示了TAGLN和JAG1与αSMA同时以相对较低水平（<4）表达的细胞，表明JAG1在SM22+αSMAlow细胞中的表达高于SM22+αSMAhigh细胞。以上结果表明 PV-SMCs 的不成熟状态与 BD 发展的早期阶段相关。

接下来，研究人员调整了之前用于从hiPSC 诱导血管SMC的分化方案，以研究当作为hiPSC-BV的组分加入时，hiPSC-SMC的不同成熟阶段是否影响其触发双能肝祖细胞朝向胆管细胞方向发展的细胞命运决定的能力。在hiPSC-SMC分化期间，免疫荧光和qPCR数据显示，分化后第6天出现SM22+αSMAlow细胞称为hiPSC-imSMCs，而分化后第10天出现SM22+αSMAhigh细胞称为hiPSC-SMCs。qPCR分析显示JAG 1在hiPSC-imSMC中高度表达，表明imSMC可能具有更高的诱导胆管细胞分化的潜力。

图1 PV-SMC沿腹腔-外围轴的发育梯度表明，它与胆管细胞祖细胞的最早分化有关

2、hiPSC-BV与hiPSC-肝类器官组合的3D共培养系统诱导hiPSC-BD的产生（图2）

本研究利用胶原蛋白-1支架产生hiPSC-BV，hiPSC-BV结构由作为外层的hiPSC-imSMC和作为划定内层的hiPSC-EC组成。为了建立3D培养系统，研究人员进一步利用片状肝类器官被指定覆盖在hiPSC-BV管周围，之后施加细胞外基质（ECM）以涂覆外层。宏观成像和免疫染色观察结果表明，仅含有细胞的hiPSC-BV不足以诱导胆管细胞分化。片状肝类器官与含有JAG1/TGFβ1/层粘连蛋白511重组蛋白的hiPSC-BV共培养后，kusabira橙色标记的HE（KO-HE）衍生细胞肉眼可见地定位于网状结构中。免疫染色分析表明，hiPSC肝内胚层细胞（HEs）衍生细胞形成CK19+BD样管腔结构。苏木精和伊红染色和定量表明BVLO内显著的BD管腔形成。为了研究BVLO的细胞组分如何随时间改变基因表达，通过流式细胞术分选后对每种细胞类型进行qPCR分析。首先，使用GFP标记的EC和GFP标记的SMC来区分hiPSC-BV细胞与肝类器官细胞。接下来，进行APC-CD31染色以区分这两种细胞类型。SMC相关基因表达（αSMA、SM22、JAG1）和EC相关基因表达（TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、VE-CAD）的qPCR分析表明，在整个共培养过程中的不同时间点，两种BV细胞群特征均无显著变化。接下来，为了更好地理解从HEs分化胆管细胞期间的基因表达变化，通过流式细胞术分选BVLO中的KO+细胞，并通过qPCR分析胆管细胞线性标记基因的表达。与上皮细胞骨架（KRT7）和BD转运蛋白（GPBAR1）相关的基因表达显著上调，即 BVLO中HE细胞部分分化为胆管细胞。除此之外，还可以观察到其他BD转运蛋白（AQP1和CFTR）基因表达增加的趋势。通过免疫荧光分析进一步检查了BVLO中的导管结构。数据表明BVLO中的BD样结构表现出BD标志物（CK19、CK7、GRHL2）、紧密连接（ZO-1、CLDN4）、上皮标志物（E-cad）和顶端-基底极化标志物（F-actin、βCAT、RDX）的阳性表达。这些发现表明，当与含有JAG1、TGFβ1和Laminin511的hiPSC-BV共培养时，源自HEs的hiPSC-肝祖细胞分化为形成 BD 样结构的胆管细胞。

图2 优化的人iPSC来源的血管在hiPSC血管加入的肝类器官（BVLO）内诱导管状胆管结构。

3、hiPSC-胆管建立上皮结构并具有分泌功能和肝表面移植促进BVLO患者胆管细胞成熟（图3）

研究人员进一步评估了BVLO-BD的结构和功能特征，以确定其功能。免疫荧光分析表明，在BVLO内，CK19+ CK7+胆管细胞围绕细长的管腔，表明BVLO中hiPSC-胆管细胞形成BD小管。透射电子显微镜（TEM）成像显示存在从BD顶膜延伸到管腔中的微绒毛，TEM还证实了细胞间隙的紧密连接结构。胆管细胞的分泌功能依赖于BD腔顶侧的特异性转运蛋白。为了评估将多药耐药蛋白1（MDR1）定位在顶膜上的BVLO-BD的功能，研究人员评估了其将MDR 1物质罗丹明123（Rho123）外排至管腔的能力。通过实时成像和免疫荧光分析，研究人员观察到Rho123在BD管腔中积累。使用维拉帕米（MDR1抑制剂）时，研究人员观察到Rho123没有积聚到BD管腔中，而是定位在BD细胞内。这说明小管BVLO-BD具有MDR1依赖性外排功能。除了Rho123测定外，研究人员还进行了毛喉素诱导的肿胀测定来评估胆管细胞的分泌功能。首先证实了囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）表达于BVLO-BD的顶膜上。接下来还发现毛喉素处理后，管腔直径显著增加，并且BVLO中BD的横截面积平均增加2.5倍。此外，研究人员还检测了γ谷氨酰转移酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）的酶活性，这两种酶位于肝细胞的胆极和胆管细胞中，并分泌到成人肝脏的胆汁中。研究人员观察到BVLO在共培养后表现出GGT酶活性，BCIP/NBT染色检测在BVLO内形成BD腔的hiPSC-胆管细胞中的ALP活性。上述结果表明，BVLO内空间组织的hiPSC-BD建立了BD特异性结构和功能特征。

为了研究胆管细胞是否会在体内进一步分化，研究人员在免疫缺陷小鼠的肝脏表面引入BVLO。移植后，研究人员观察到在顶端表面上OPN和乙酰化微管蛋白的阳性表达，其在体外共培养后未检测到，表明在体内孵育后成熟提前。为了检查可能的宿主-移植物BD连接，研究人员通过从肝外BD（EHBD）注入碳墨水来可视化BD的连续管腔网络BVLO移植小鼠，用免疫荧光染色分析注射了碳墨的肝组织，证实了碳墨水在Ku80+移植物区域内、与宿主mOPN+ IHBDs相邻的hCK7+ BD管腔内积聚。

图3 BVLO的体外和体内功能表征

4、BVLO移植暂时改善胆汁淤积性疾病的症状（图4）

研究发现，宿主-移植物BD连接是在移植后建立的。研究人员对免疫缺陷小鼠进行胆管结扎（BDL），通过胆汁在肝组织内积聚来诱导胆汁淤积性肝损伤。在BDL后立即将BVLO移植到肝脏表面上。BDL后明显诱发了黄疸。假手术小鼠的平均存活期仅为4天，而接受BVLO移植的小鼠的平均存活期显著提高至7天。与假手术组相比，BVLO移植组小鼠的直接胆红素和总胆红素（D-Bil和T-Bil）升高较少，体重减轻较少。最后，厚切片移植肝脏显示移植物-BDs的管腔空间变大。研究人员假设BVLO的外部胆管结构在宿主-移植物连接时，可能作为受体肝脏的辅助胆汁储库，从而有助于暂时缓解胆汁淤积症状。

图4 BVLO 肝表面移植后胆管结扎小鼠模型的存活率暂时提高

5、scRNAseq分析表明BV-BD通过BVLO中的TGFβ和Notch途径相互作用（图5）

scRNA-seq分析鉴定了BVLO内的肝细胞、内皮细胞和间充质细胞以及胆管细胞。接下来，又将BVLO数据与公开可用的人成体肝细胞（GSE192742）的scRNA-seq数据相结合，以证明BVLO组成细胞与原代人肝细胞之间的相似性。分析结果显示，人类肝细胞亚群为5个亚群，BVLO肝细胞亚群为4个。此外，鉴定了三个不同的胆管细胞群，BVLO胆管细胞亚群为其中之一。肝细胞和胆管细胞的相似性通过显示肝胆标志物基因的表达谱的热图进一步说明，突出了相应细胞类型之间的共同特征。利用scRNA-seq数据，研究人员分析了可能的细胞间相互作用，通过分别指定MC或EC为“发送者”细胞（提供配体的细胞），以及胆管细胞为“接收者”（接收配体的细胞），来提取BV-BD相互作用的分子信息。分析表明，TGFβ信号通路是EC和MC-胆管细胞相互作用中最显著的通路，而JAG 1-Notch信号通路似乎主要在MC-胆管细胞相互作用中被激活。以上结果表明，BVLO组分细胞的转录组分析表明，TGFβ和Notch信号通路在BD中被激活，可能是由BV组分细胞诱导的。

图5 单细胞转录组分析证明了BVLO中的PV-BD相互作用

6、TGFβ和Notch信号通路参与hiPSC-BD的发展（图6）

为了研究这些信号通路在BD形成中的作用，引入ALK4/5/7抑制剂（A8301）来阻断TGFβ信号通路，或引入γ-分泌酶抑制剂（DAPT，L685458）来阻断Notch信号通路。相应抑制剂的处理导致BD结构的形成完全消除，而胆管细胞分化被抑制但未被完全阻断。尽管scRNA-seq数据的NicheNet分析表明ECs和imSMCs均提供TGFβ1，qPCR数据表明TGFβ1主要由ECs提供和JAG1由imSMCs提供。为了检测通过TGFβ1和JAG1/Notch途径的细胞间通讯，将TGFβ1加入hiPSC-imSMC培养物中并检测JAG1表达。TGFβ1重组体的加入增加了imSMC的JAG1表达，而A8301处理消除了该表型，这表明TGFβ1通过上调JAG1而作为Notch途径的上游。为了阐明hiPSC-BV细胞成分的JAG1表达在BVLO中BD腔形成中的作用，研究人员通过使用源自两个JAG1敲除（JAG1-/-）hiPSC克隆的imSMCs以及JAG1野生型（JAG1+/+）克隆构建了hiPSC-BV，然后将它们与肝脏类器官共培养。虽然JAG1+/+ hiPSC-imSMCs BV作为BVLO内BD形成的阳性对照，但研究人员的免疫荧光分析和CK7+管腔定量数据表明，与含有两种JAG1−/− hiPSC衍生的imSMCs之一的BV共培养的BVLO不能形成BD管腔。尽管JAG1在imSMCs中对于BD管腔形成具有不可或缺的作用，但JAG1−/− hiPSC-肝祖细胞仍然能够在BVLO中形成BD管腔。这种区别强调了在BD形成的发育过程中对JAG1的不同需求，突出了与其在hiPSC-肝祖细胞中的作用相比，JAG1在imSMCs中的独特作用。

图6 BVLO内胆管形成对JAG1/NOTCH的依赖性，TGFβ信号增强了JAG1/NOTCH

小结

上皮类器官与人工BV共培养的方法提供了在体外衍生复杂肝脏结构的能力，hiPSC-BD不仅能够用于先天性胆道疾病建模，还可用于再生医学。BV不仅促进血液循环以向组织/器官组成细胞输送营养物质和氧气，而且在模拟BV-上皮相互作用时BV还可以促进上皮形态发生，促进人类上皮类器官中3D生理功能组织结构的发展。因此BV整合到类器官中已成为许多研究人员的近期目标。

参考文献

Carolina E, Kuse Y, Okumura A, Aoshima K, Tadokoro T, Matsumoto S, Kanai E, Okumura T, Kasai T, Yamabe S, Nishikawa Y, Yamaguchi K, Furukawa Y, Tanimizu N, Taniguchi H. Generation of human iPSC-derived 3D bile duct within liver organoid by incorporating human iPSC-derived blood vessel. Nat Commun. 2024 Aug 28;15(1):7424. doi: 10.1038/s41467-024-51487-3. PMID: 39198465; PMCID: PMC11358266.

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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社