Cancer Cell:具核梭杆菌有助于微卫星稳定型结直肠癌的抗PD-1治疗
微卫星稳定型（MSS）结直肠癌（CRCs）通常对抗程序性死亡-1（PD-1）治疗具有耐药性。中山大学附属第一医院于君团队发现一种CRC病原体，即核梭杆菌（Fn），矛盾地使MSS CRC对抗PD-1敏感。与Fn含量低的MSS CRC患者相比，来自Fn含量高的MSS CRC患者的粪便微生物群移植（FMT）到携带MSS CRC的无菌小鼠中可增加抗PD-1的敏感性。在携带MSS CRC的小鼠同种异体移植物和CD34+人源化小鼠中，单次进行Fn给药也增强了抗PD-1的功效。在机制上，肿瘤内Fn产生丰富的丁酸，抑制CD8+T细胞中的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）3/8，诱导Tbx21启动子H3K27乙酰化和表达；TBX21通过转录抑制PD-1，缓解CD8+ T细胞耗竭，促进效应细胞功能；敲除Fn中产生丁酸的基因可消除其抗PD-1增强作用。在MSS CRC患者中，肿瘤内高Fn预示着抗PD-1治疗反应良好，表明Fn是MSS CRC免疫治疗反应的潜在生物标志物。
图形摘要
文章介绍
题目：Fusobacterium nucleatum facilitates anti-PD-1 therapy in microsatellite stable colorectal cancer
杂志：Cancer Cell
影响因子：IF=48.8
发表时间：2024年9月
#1
研究背景
Background
单抗Pembrolizumab靶向PD-1，已被批准作为MSS CRC患者的一线治疗。然而，85%的CRC患者属于MSS，由于反应性差异，不适合免疫检查点阻断（ICB）疗法。如何对MSS CRC患者进行ICB治疗有效的分层仍然具有挑战性，并且迫切需要提高其疗效。肠道菌群对宿主的免疫系统有着深远的影响，Fn是一种革兰氏阴性厌氧菌，被认为是结直肠癌的致病病原体。Fn在结直肠癌中富集，其丰度与肿瘤进展呈正相关。到目前为止，Fn是否以及如何在MSS CRC的背景下调节ICB治疗反应在很大程度上尚未被探索。
本研究解释了Fn在MSS CRC中调节抗PD-1单克隆抗体（mAb）免疫治疗反应的潜在功能及其潜在的分子机制，发现在MSS CRC患者中Fn丰度与PD-1表达呈负相关。在MSS CRC人源化小鼠模型中，Fn通过抑制肿瘤免疫微环境（TIME）中CD8+ T细胞衰竭来提高抗PD-1治疗效果。在无菌的人源化小鼠中，Fn单定殖重现了这种效果。在机制上， Fn衍生的代谢物丁酸作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，在Tbx21启动子处增加H3K27ac水平，从而激活Tbx21信号传导，抑制PD-1表达和CD8+ TIL衰竭。然而丁酸盐生物合成中Fn缺失的突变体对CD8+ 肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）和抗PD-1的效果没有产生类似的影响。因此，该研究结果确定了Fn在MSS CRC对抗PD-1治疗的敏感性中的作用，以及预测抗PD-1治疗CRC疗效的生物标志物。
#2
研究关键点
Key points
Fn增强微卫星稳定型结直肠癌（MSS CRC）抗PD-1疗效；
Fn抑制CD8+ 肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）上PD-1的表达，并激活其效应功能；
Fn衍生丁酸通过HDAC3/8-TBX21轴下调CD8+ TILs上的PD-1；
肿瘤内Fn高丰度与MSS CRC的有利应答相关。
#3
关键研究结果
Results
1.高Fn丰度预测MSS CRC患者和原位MSS CRC无菌小鼠对抗PD-1免疫治疗的有利反应
Fn丰度与抗PD-1治疗的Mss CRC患者的无进展生存期和总生存期呈正相关；荧光原位杂交（FISH）检测显示，肿瘤内Fn高的患者在抗PD-1治疗后预后良好；计算机断层扫描显示，与缺氮患者相比，富氮患者CRC肝转移的抗PD-1治疗反应更高，表明Fn可能改善MSS CRC患者的抗PD-1治疗结果。在无菌小鼠中建立原位CT26同种异体移植物，然后用高/中/低Fn患者的粪便进行FMT加上抗PD-1治疗。与PBS+IgG相比，只有接受高Fn患者FMT治疗的小鼠对抗PD-1有显著反应，肿瘤重量和肿瘤体积减小。因此，与其他各组相比，高Fn+抗PD-1组肿瘤细胞凋亡更多，而增殖更少。高Fn+抗PD-1治疗可调节CD8+ TILs， PD-1+CD8+ TILs降低，TNF-α+、GZMB+和IFN-γ+ CD8+ TILs升高。免疫组织化学（IHC）证实，高Fn+抗PD-1抑制PD-1，但增加TNF-α、GZMB和IFN-γ的表达。FISH检测证实，与其他组相比，高Fn FMT后肿瘤中Fn富集。总之，与接受中或低Fn患者粪便的小鼠相比，无菌小鼠与高Fn MSS结直肠癌患者粪便的定殖提高了抗PD-1的功效（图1）。
图1 高肠道Fn丰度预示着MSS CRC患者对抗PD-1的良好反应，使用Fn丰度高的结直肠癌粪便进行粪便微生物群移植，可促进原位MSS CRC同种异体移植无菌小鼠的抗PD-1效果
2.Fn通过抑制PD-1+CD8+ TILs，促进人源化小鼠模型和原位MSS CRC小鼠免疫模型的抗PD-1反应
首先建立了CD34+人源化NOD scid γ小鼠，植入原位HT29异种移植物，hCD45+细胞占循环淋巴细胞的25%以上，证实移植成功（图2B）。用抗生素清除这些小鼠的肠道微生物群，然后用Fn或PBS（对照组），含或不含抗PD-1单抗（aPD-1）灌胃。Fn灌胃加速了原位HT29肿瘤的生长；在PBS治疗的小鼠中，单独抗PD-1对抑制肿瘤生长无效；Fn增强抗PD-1治疗的疗效，导致肿瘤缩小。从肿瘤溶解物中培养出Fn活菌和FISH证明Fn成功定植结肠肿瘤。抗PD-1降低了肿瘤组织中Fn丰度，但在邻近的正常结肠组织中没有降低Fn丰度，提示抗PD-1损害了肿瘤内的Fn。与Fn介导的抗PD-1功效增强一致，与所有其他组相比，Fn+抗PD-1组诱导了Tdt介导的TUNEL+凋亡细胞，同时通过PCNA和Ki67染色检测到细胞增殖降低。肿瘤浸润免疫细胞分析显示Fn+抗PD-1增加CD8+ TILs。Fn降低PD-1+CD8+ TILs，特别是与抗PD-1联合使用。此外，Fn+anti-PD-1增加TNF-α+、GZMB+和IFN-γ+ CD8+ TILs。免疫组化证实Fn+抗PD-1抑制PD-1的表达，但增加GZMB和TNF-α的表达。这些数据表明，在MSS CRC人源化模型中，Fn可缓解CD8+ TIL耗竭，并联合抗PD-1抑重新激活细胞毒性CD8+ TIL介导肿瘤细胞杀伤（图2）。
图2 Fn增强SPF免疫人源化小鼠携带原位MSS CRC异种移植物抗PD-1的功效
3.Fn在无菌、CD34+人源化小鼠中的单定殖促进全身CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫
为了确定单独使用Fn是否能引起全身CD8+ T细胞反应，该研究开发了无菌、CD34+人源化的小鼠，随后用Fn、U159A对照或PBS对照进行单定殖，并皮下植入HT29异种移植物，hCD45+细胞约占循环淋巴细胞的30%。与UA159或PBS相比，Fn灌胃可降低HT29异种移植物的生长，降低肿瘤重量和体积。Ki-67/PCNA和TUNEL检测证实Fn组细胞增殖减少，诱导细胞凋亡。此外，Fn抑制了CD8+ TIL中PD-1的表达，而流式细胞术和免疫组化证实，与所有其他组相比，Fn增加了CD8+ TIL数量，TNF-α+、GZMB+和IFN-γ+在CD8+ TIL中的表达。这些结果表明，Fn单定殖通过诱导CD8+ TILs的全身激活来增强抗肿瘤免疫（图3）。
图3 Fn通过系统激活无菌免疫人源化小鼠皮下移植的MSS CRC异种移植物和SPF小鼠原位移植的MSS CRC异体移植物的CD8+ TILs来促进抗PD-1的功效
4.Fn通过其代谢物丁酸降低PD-1表达，激活CD8+ T细胞
为了评估Fn分泌分子是否参与增强抗PD-1疗效，该研究建立原位和皮下CT26同种异体移植物。在原位CT26同种异体移植物中，小鼠随机接受Fn条件培养基（CM）、UA159 CM或肉汤对照培养基灌胃，并接受抗PD-1或对照IgG。与UA159 CM组相比，Fn CM组在肿瘤重量和体积方面均抑制CT26同种异体移植物的生长。在肉汤对照或UA159 cm处理的小鼠中，抗PD-1未能抑制肿瘤生长。相比之下，抗PD-1+Fn CM降低了肿瘤重量和体积。Fn CM激活了TILs，PD-1+CD8+ TILs减少，但TNF-α+、GZMB+和IFN-γ+ CD8+ TILs增加，特别是与抗PD-1结合。综上所述，Fn分泌蛋白增强了MSS结直肠癌中抗pd -1的疗效（图3）。
为了破译Fn CM的活性成分，该研究根据Fn CM的分子大小（<3 kDa, 10-100 kDa， 3-10 kDa和>100 kDa）对其进行分离，发现<3 kDa的部分在抑制CD8+ T细胞中的PD-1水平和增强细胞毒性功能方面最有效。蛋白酶K处理对Fn CM对PD-1的调节没有影响，意味着Fn CM介导的PD-1抑制涉及低分子量代谢物。接下来，设计了一系列实验来鉴定所涉及的代谢物。Fn CM （<3 kDa）与空白培养基、Fn灌胃与PBS灌胃无菌小鼠粪便的非靶向代谢组学显示，Fn改变了代谢物谱。体外和体内富集Fn代谢物重叠鉴定出37种富集代谢物，其中丁酸是富集最多的候选代谢物。为了验证，进行了短链脂肪酸（SCFAs）的靶向分析，Fn CM和Fn灌胃无菌小鼠粪便中富集了丁酸、乙酸、丙酸、戊酸等短链脂肪酸。为了了解富Fn的代谢产物是否会调节CD8+ T细胞，使用脾脏CD8+ T细胞进行了共培养研究。在脾脏CD8+ T细胞中，只有丁酸以剂量依赖性的方式降低PD-1表达，同时诱导TNF-α、GZMB和IFN-γ。Fn CM或丁酸均能刺激CT26同种异体移植肿瘤CD8 TILs的激活。这些发现表明Fn通过产生丁酸逆转CD8+ T耗竭并增强细胞毒性功能（图4）。
图4 Fn通过其小分子代谢产物降低CD8+ T细胞PD-1的表达
5.丁酸生物合成缺陷突变体Fn在体外不能激活CD8+ T细胞和抗PD-1反应
Fn通过发酵途径的酶生物合成丁酸。因此，该研究产生了一个具有突变型烯酰辅酶A水合酶（FNO271，丁酸发酵的必需酶）的Fn菌株。通过气相色谱-质谱（GC-MS）检测，FNO271突变体Fn菌株缺乏丁酸生物合成。与WT Fn CM或丁酸相比，FNO271突变体Fn CM减少PD1+CD8+ T细胞的效果明显较差，并且不能诱导GZMB+、TNF-α+、IFN-γ+ CD8+ T细胞。团队还进行了CD8+ T细胞羧基荧光素琥珀酰酰酯实验，结果显示WT Fn CM或丁酸均可诱导CD8+ T细胞增殖，而FNO271突变体Fn CM则没有作用。为了模拟体外抗PD-1治疗，团队富集了CT26荷瘤小鼠的CD8+ TILs，并在Fn CM或FNO271突变体Fn CM中共培养，无论是否含有抗PD-1。团队研究结果证实，WT Fn CM增强了抗PD-1抑制PD-1在CD8+ T细胞上表达的作用，导致协同诱导细胞毒性标志物（GZMB和IFN-γ），而FNO271突变体Fn则无效。以上数据证实，Fn的CD8+ T细胞促进功能依赖于丁酸的产生（图5）。
图5 Fn通过其代谢产物丁酸增强抗PD-1治疗的反应
6.Fn通过丁酸生物合成增强与自体 CD8+ T 细胞共培养的 MSS CRC 患者来源的类器官中的抗 PD-1 功效
为了探索Fn是否可以通过丁酸在人体免疫系统中增强抗PD-1的功效，团队建立了原代CRC类器官，与来自同一患者的自体外周血单核细胞（PBMC）来源的CD8+ T细胞共培养，然后添加Fn CM、FN0271突变体Fn CM或丁酸，含或不含抗PD-1。为了评估肿瘤细胞杀伤，用caspase-3/-7绿色探针标记CRC类器官，Fn CM+抗PD-1或丁酸+抗PD-1组合，而不是FNO271突变体Fn CM+抗PD-1，显著触发CRC类器官的凋亡。anti-cleaved caspase-3/-7探针染色后的流式细胞术分析结果一致。与这些发现一致，WT Fn CM增强抗PD-1抑制PD-1，促进GZMB和IFN-y在CD8+ T细胞中的表达，而FNO271突变体Fn CM没有作用（图6）。
图6 Fn通过其代谢产物丁酸在MSS CRC患者PBMCs与类肿瘤器官的自体共培养体系中增强抗PD-1 mAb的肿瘤杀伤作用
7.丁酸促进CD8+ TIL介导的MSS CRC体内抗肿瘤免疫反应
为了验证丁酸是通过激活CD8+ TILs来增强抗PD-1治疗的关键Fn衍生代谢物，使用抗CD8α单抗比较了丁酸、抗PD-1或它们联合在CT26同种异体移植物中使用CD8+细胞消耗或不使用CD8+细胞消耗的效果。与对照组相比，单用丁酸可降低肿瘤生长，添加抗PD-1可提高其疗效。正如预期的那样，丁酸加抗PD-1诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞生长的效果最强。此外，丁酸增加了CD8+ TILs，降低了PD-1+CD8+ TILs，同时增加了细胞毒性标志物，尤其是与抗PD-1联合使用时。值得注意的是，通过抗CD8α单抗去除CD8+ T在很大程度上消除了丁酸加抗PD-1抑制CT26同种异体移植物生长的作用。因此，Fn-丁酸轴通过缓解CD8+ TIL耗竭和重新激活其细胞毒性功能，以CD8+ T细胞依赖的方式促进MSS CRC的抗PD-1免疫治疗（图7）。
图7 Fn衍生的丁酸盐以CD8+ T细胞依赖的方式促进MSS CRC的抗PD-1治疗
8.Fn及其代谢物丁酸通过上调TBX21调控CD8+ T细胞的转录程序
为了确定Fn抑制PD-1表达的机制，利用RNA测序分析Fn CM、FNO271 KO Fn CM和空白培养基（Ctrl）处理的CD8+ T细胞。通过主成分分析分析，Fn CM显著改变了CD8+ T细胞中的基因表达谱，而FNO271 KO Fn CM与对照组一起分离。此外，Fn CM诱导了多种效应T细胞相关基因，包括Gzmb、Gzmc、Ifng和Tnf，而与FN0271突变体Fn CM或Ctrl相比，Pdcd1（PD-1）下调。激活T细胞中表达的关键转录因子Tbx21被Fn CM特异性上调。丁酸重现了Fn CM促进Tbx21、Ifng、Tnf和Gzmb表达的作用，强调了其在CD8+ T细胞中Fn诱导的信号传导中的作用。由于Tbx21对T细胞活化至关重要，该研究假设Fn及其代谢物丁酸可能通过Tbx21调节CD8+ T细胞。为了验证这一观点，在CD8+ T细胞中进行了Tbx21敲除（KO），发现Tbx21 KO增加了PD-1蛋白表达，并消除了Fn CM或丁酸对PD-1+CD8+ T细胞的抑制作用，从而阻止了CD8+ T细胞的活化，这表明Tbx21是由Fn-丁酸轴激活的中心节点，以增强CD8+ TIL抗肿瘤反应（图8）。
图8 Fn代谢产物丁酸通过表观遗传机制调控CD8+ T细胞上调TBX21（T-bet）
9.Fn及其代谢物丁酸通过H3K27乙酰化促进TBX21转录
丁酸可以通过G蛋白偶联受体（GPR41/43/109）或阻断HDACs来调节信号转导。首先使用FITC标记的示踪剂追踪丁酸在CD8+ T细胞中的定位，发现它在CD8+ T细胞的细胞核中积累。Pan-HDAC活性测定表明，Fn CM或丁酸下调HDAC活性，而FNO271突变的Fn CM没有影响。为了了解HDAC抑制是否可调节CD8+ T细胞中的PD-1表达，使用Pan-HDAC抑制剂以及HDACⅰ类、ⅱ类、ⅲ类和ⅳ类特异性抑制剂处理CD8+ T细胞，结果表明Pan-HDAC或ⅰ类HDAC阻滞剂可抑制PD-1表达。相反，HDAC激动剂ITSA-1增加了PD-1+CD8+ T细胞。对单个I类HDACs的阻断（1/2/3/8）发现，HDAC3i RGFP966或HDAC8i PCI-3405I剂量依赖性地减少了PD-1+CD8+ T细胞，提示HDAC3/8参与调节PD-1表达。Fn CM或丁酸（而非FNO271突变的Fn CM）一致抑制HDAC3/8。这些数据推测Fn或丁酸通过抑制CD8+ T细胞中的HDAC3/8来调节PD-1的表达（图8）。
小结
Fn是一种可促进CRC进展、转移和化疗耐药的已知致病菌。在本研究中，揭示了Fn及其代谢产物在增强MSS结直肠癌（一种对免疫治疗反应不佳的结直肠癌亚型）抗PD-1治疗疗效中的矛盾功能。在机制上，该研究证明了Fn生物合成丁酸，而丁酸通过表观遗传激活TBX21（T-bet）转录因子抑制CD8+ TILs中的PD-1表达，从而提高细胞毒性CD8+ TILs和肿瘤细胞杀伤作用，并与抗PD-1结合。高Fn丰度的免疫冷MSS CRC可能预示抗PD-1治疗的良好反应。
参考文献
Wang X, Fang Y, Liang W, Wong CC, Qin H, Gao Y, Liang M, Song L, Zhang Y, Fan M, Liu C, Lau HC, Xu L, Li X, Song W, Wang J, Wang N, Yang T, Mo M, Zhang X, Fang J, Liao B, Sung JJY, Yu J. Fusobacterium nucleatum facilitates anti-PD-1 therapy in microsatellite stable colorectal cancer. Cancer Cell. 2024 Oct 14;42(10):1729-1746.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2024.08.019. Epub 2024 Sep 19. PMID: 39303724.
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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社