顶刊发文：类器官来源视网膜干细胞外囊泡的脂肪酸代谢调节功能

本文来源：类器官学社、盛合瑞生物

文章介绍

2023年12月27日，陆军军医大学徐海伟、邹婷、范晓棠等人在期刊Journal of Extracellular Vesicles（IF:15.5）发表了一篇题为“Extracellular vesicles from organoid-derived human retinal progenitor cells prevent lipid overload-induced retinal pigment epithelium injury by regulating fatty acid metabolism”（类器官来源的人视网膜干细胞分泌的外囊泡可通过调节脂肪酸代谢保护脂质过载诱导的视网膜色素上皮损伤）的高质量文章。

该研究基于4D蛋白组学揭示了视网膜类器官的干细胞外囊泡脂肪酸代谢的调控特征，这一特性可挽救由于油酸堆积所导致的视网膜色素上皮细胞损伤，为类器官来源的干细胞产品临床应用提供了新思路。

#1

摘要

Abstract

视网膜变性是一种导致视力丧失的疾病，通常涉及视网膜细胞损伤。干细胞来源的胞外囊泡为治疗提供了一个新的方法。人视网膜类器官源性视网膜祖细胞（hERO-RPCs）是一种潜在的治疗源，但其细胞外囊泡（EVs）尚未被充分研究。该研究比较了hERO-RPCs来源的EVs与人类胚胎干细胞来源的EVs，发现它们在蛋白质组成上存在显著差异。hRPC-EVs显示出对脂质代谢的独特调节能力，能够消除脂质沉积、抑制脂毒性和氧化应激，并增强ARPE-19细胞的吞噬作用和存活率。因此，hRPC-EVs代表了一种有前途的治疗视网膜变性等疾病的新方法，特别是对于与RPE细胞异常脂质代谢相关的疾病。

#2

研究思路

Methods

该研究探讨了人视网膜类器官源性视网膜祖细胞（hERO-RPCs）来源的细胞外囊泡（EVs）在保护视网膜色素上皮（RPE）免受脂质过载诱导的损伤方面的潜力。首先，对hERO-RPCs及其分泌的EVs进行了制备和表征，利用免疫荧光染色法鉴定了hERO和培养细胞，并对其细胞组成和特性进行了深入研究。通过透射电子显微镜和纳米粒子跟踪分析法对EVs进行详细表征，确保准确评估其物理性质和浓度。之后采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析，鉴定和定量EVs中的蛋白质内容。通过这种方法，发现了一些特定蛋白质，它们参与调节脂肪酸代谢和RPE保护。这些研究发现，hRPC-EVs具有独特的调节脂质代谢的能力，能够消除脂质沉积、抑制脂毒性和氧化应激，并增强ARPE-19细胞的吞噬作用和存活率。

#3

主要结果

Results

hRPC-EVs和hESC-EVs的特点或特性

蛋白质组学分析表明，hESC-EVs富含与血管生成和细胞增殖相关的蛋白质，这表明它们在促进血管修复和细胞增殖方面具有潜在作用。相比之下，hRPC-EVs富含与免疫调节、视网膜发育和脂质代谢相关的蛋白质，这表明它们在调节免疫反应和视网膜脂质稳态方面具有潜力。

hRPC-EVs和hESC-EVs均由小（<200nm）和中/大（>200nm）的EVs组成，其中>200nm的EVs在hRPC-EVs中占比较高。特定的EV标记物，如CD81、TSG101、CD9和CD63，在hRPC-EVs和hESC-EVs中均有富集，这表明这两种EVs在生物发生和货物装载方面具有不同的机制。研究发现，hRPC-EVs的蛋白质装载选择性高于hESC-EVs，这表明在EV生物发生过程中存在独特的货物选择过程。hRPC-EVs含有大量分泌或腔内蛋白质，这表明它们具有靶向特定功能蛋白的潜力，而hESC-EVs表现出更高的蛋白质保守性。

图1 人胚胎干细胞（hESCs）和人视网膜类器官源性视网膜祖细胞（hRPCs）来源的细胞外囊泡（EVs）的分离和表征。（a）视网膜类器官的诱导和实验设计示意图。（b）hESCs和hRPCs在光场下的典型形态。（c）hESC标记物（SSEA4，NANOG和OCT4）和hRPC标记物（RAX，CHX10和PAX6）的荧光染色。（d，e）通过纳米粒子跟踪分析获得hESC-EVs和hRPC-EVs的大小分布和百分比。（f）显示来自hESCs和hRPCs的EVs形态的透射电子显微镜图像。（g）通过Western blot鉴定hESCs，hRPCs，hESC-EVs和hRPC-EVs中的EV标记物。

由hESCs和hRPCs产生的胞外囊泡表现出显著的差异

研究使用液相色谱-质谱（LC-MS/MS）技术对来自人类胚胎干细胞（hESCs）和人类视网膜祖细胞（hRPCs）的细胞外囊泡（EVs）进行了全面的蛋白质组学分析。通过比较hESC-EVs和hRPC-EVs的蛋白质组成，揭示了它们之间显著的差异。具体来说，hESC-EVs富集了与血管生成、细胞增殖和多能性维持相关的蛋白质，而hRPC-EVs富集了与免疫调节、视网膜发育和脂质代谢相关的蛋白质。此外，研究还发现hRPC-EVs的蛋白质负载更为选择性，而hESC-EVs则表现出更高的蛋白质保守性。

图2 蛋白质组学分析hESCs-EVs、hRPC-EVs及其细胞来源。(a)四个组中鉴定的蛋白质数量。(b)四个组中所有鉴定蛋白质的表达热图。(c)所有样本的蛋白质定量主成分分析(PCA)。(d-f)所有组中三种类别EV相关标记的表达热图。跨膜或GPI锚定蛋白（d）。在EVs中回收的分泌或腔内蛋白（e）。胞质或周质蛋白（f）。

比较hESC和hESC-EV组之间的蛋白质组学结果

在研究中，通过比较hESCs和hESC-EVs的蛋白质组成，揭示它们之间的差异。研究使用液相色谱-质谱（LC-MS/MS）技术对这两种样本进行了全面的蛋白质组学分析。结果显示，hESC-EVs和hESCs之间共同表达了5573种蛋白质，其中447种蛋白质仅在hESCs中表达，而336种蛋白质仅在hESC-EVs中表达。此外，有1794种蛋白质在hESC-EVs和hESCs之间被识别为差异表达蛋白（DEPs），其中667种蛋白质在hESC-EVs中高表达，而1127种蛋白质在hESCs中高表达。GO分析表明，hESC-EVs中高表达的蛋白质与细胞分泌和囊泡介导的转运密切相关，而KEGG通路分析则证实了hESC-EVs和hESCs之间在EV生物合成、分泌和转运等方面的显著差异。此外，与能量代谢（氧化磷酸化和柠檬酸循环）和脂肪酸代谢相关的蛋白质在hESC-EVs中并不丰富。这些结果表明，hESC-EVs和hESCs之间存在显著的蛋白质组成差异，这些差异可能反映了它们在细胞生物学和生理学上的不同功能。

图3 比较hESC和hESC-EV组之间的蛋白质组学结果。(a)显示hESC和hESC-EV组中鉴定蛋白质的Venn图。(b)比较hESC和hESC-EV组中高表达和低表达蛋白质的火山图。(c)hESC和hESCs-EV蛋白质组的Pearson相关热图。(d)对hESC-EVs（红色列）和hESCs（蓝色列）中高表达蛋白质进行基因本体（生物过程）分析。(e)对hESC-EVs和hESCs中高表达蛋白质进行KEGG分析。(f)通过基因集富集分析（GSEA）确定hESC-EVs与hESCs相比显著上调的基因集。(g-i)通过GSEA确定hESC-EVs与hESCs相比显著下调的基因集。

比较hRPC和hRPC-EV组之间的蛋白质组学结果

比较hRPC和hRPC-EV组之间的蛋白质组学结果揭示了它们在蛋白质组成方面的显著差异。通过使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行综合蛋白质组学分析，该研究确定了存在于hRPC-EVs和hRPCs中的5574种蛋白质，其中594种蛋白质是hRPCs特有的，84种蛋白质是hRPC-EVs特有的。此外，还鉴定了1905种差异表达的蛋白质（DEPs），其中546种蛋白质在hRPC-EVs中显著富集，1359种蛋白质在hRPCs中富集。值得注意的是，hRPC-EVs与hRPCs之间的相关性较低，这表明在hRPC-EV分泌过程中存在更具选择性的过程。通过基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径分析，确定了与hRPC-EVs相对于hRPCs中高表达和低表达蛋白质相关的途径，进一步阐明了hRPC-EVs和hRPCs之间独特的蛋白质组成和潜在功能差异。

图4 比较hRPC和hRPC-EV组之间的蛋白质组学结果。(a)显示hRPC和hRPC-EV组中鉴定蛋白质的Venn图。(b)比较hRPC和hRPC-EV组中高表达和低表达蛋白质的火山图。(c)hRPC和hRPC-EV蛋白质组的Pearson相关热图。(d)对hRPC-EVs（红色列）和hRPCs（蓝色列）中高表达蛋白质进行基因本体（生物过程）分析。(e)对hRPC-EVs和hRPCs中高表达蛋白质进行KEGG分析。(f和g)通过基因集富集分析（GSEA）确定hRPC-EVs中显著上调的基因集。(h和i)通过GSEA确定hRPC-EVs中显著下调的基因集。

hESC-EVs中的蛋白质与细胞增殖的相关性比hRPC-EVs中的蛋白质更强

研究发现，与hRPC-EVs相比，hESC-EVs中的蛋白质与细胞增殖的相关性更强。通过差异表达分析，研究确定了1118种和578种高表达的差异表达蛋白质（DEPs），分别存在于hESC-EVs和hRPC-EVs中。对hESC-EVs中高表达的DEPs进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）途径分析，揭示了与RNA加工相关的几个途径，以及与细胞分裂和增殖相关的途径，如有丝分裂核分裂、纺锤体组织、细胞周期和DNA复制。相比之下，hRPC-EVs富含与免疫调节、视网膜发育和脂质代谢相关的蛋白质。hESC-EVs与hESCs之间的Pearson相关系数在0.47到0.63之间，表明hESC-EVs和hRPC-EVs之间的蛋白质水平和类型存在显著差异。这些发现表明，与hRPC-EVs相比，hESC-EVs可能具有更大的促进细胞增殖和生长的潜力。

图5 比较hRPC-EV和hESC-EV组之间的蛋白质组学结果。(a)显示hESC-EV和hRPC-EV组中鉴定蛋白质的Venn图。(b)比较hESC-EV和hRPC-EV组中高表达和低表达蛋白质的火山图。(c)hESC-EV和hRPC-EV蛋白质组的Pearson相关热图。(d)对hRPC-EVs（红色列）和hESC-EVs（蓝色列）中高表达蛋白质进行基因本体（生物过程）分析。(e)对hRPC-EVs和hESC-EVs中高表达蛋白质进行KEGG分析。(f和g)通过基因集富集分析（GSEA）确定hESC-EVs中显著上调的基因集。(h)通过GSEA分析脂肪酸β-氧化途径在hRPC-EVs和hESC-EVs中的表达。(i)通过单样本GSEA确定的脂质和脂肪酸代谢相关途径的得分热图，所有四组。(j)与脂肪酸β-氧化相关的蛋白质的表达热图，所有组。(k)通过Western blot检测CRAT和HADH蛋白的表达。

hRPC-EVs可能调节脂质代谢

研究发现，hRPC-EVs可能调节脂质代谢。通过对hRPC-EVs中高表达的DEPs进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，研究确定了与碳代谢、脂肪酸代谢、胆固醇代谢和柠檬酸循环途径相关的途径，这些途径与葡萄糖和脂质代谢密切相关。通路相互作用网络分析显示，hRPC-EVs中高表达的DEPs中的通路簇主要由四个部分组成：（1）细胞粘附和神经系统发育，（2）代谢过程，（3）免疫调节和细胞分泌，（4）伤口愈合。GSEA显示hRPC-EVs中脂肪酸β-氧化途径的上调，而与其他三组相比，hRPC-EV组中脂质和脂肪酸代谢相关途径的得分最高。这些发现表明，hRPC-EVs可能具有调节脂质代谢的潜力，这可能通过其脂质调节机制为治疗视网膜疾病提供有前途的治疗方法。

视网膜色素上皮细胞脂质过载的细胞毒性通过调节脂肪酸代谢被hRPC-EVs减弱

研究显示，hRPC-EVs通过调节脂肪酸代谢来降低视网膜色素上皮（RPE）细胞的脂质过载细胞毒性。在体外模型中，用hRPC-EVs处理显著延迟了脂质沉积，并逆转了由油酸处理的RPE细胞诱导的活性氧（ROS）产量增加。此外，与hESC-EVs相比，hRPC-EVs表现出更好的能力来逆转ROS并改善RPE细胞的吞噬作用。此外，hRPC-EVs整合到RPE细胞的线粒体网络中，增加了与脂肪酸β-氧化相关的蛋白质的表达，有助于清除多余的脂质。这些发现表明，hRPC-EVs具有通过调节脂肪酸代谢来减轻RPE细胞脂质过载细胞毒性的潜力。

图6 hESC-EVs和hRPC-EVs对油酸处理的ARPE-19细胞的影响。(a)实验设计。(b，c)代表性尼罗红染色图像和相对荧光强度分析在对照组、OA组、hESC-EV组和hRPC-EV组的ARPE-19细胞。(d)四组中的代表性活性氧（ROS）染色图像。(e)相对荧光强度分析ROS。(f)代表性图像显示ARPE-19细胞对FITC+珠子的摄取。(g)相对荧光强度分析FITC标记的珠子。

图7 RPC-EVs被摄取并整合到油酸处理的ARPE-19细胞的线粒体网络中。(a)在不同时间点，PKH26标记的RPC-EVs在OA处理的ARPE-19细胞中的摄取。(b)PKH26标记的RPC-EVs的相对荧光强度分析。(c)摄取的RPC-EVs在24小时内整合到ARPE-19细胞的线粒体网络中。(d)RPC-EVs整合到ARPE-19细胞线粒体网络中的正交图像。(e)油酸处理后ARPE-19细胞中与脂质代谢相关的蛋白质的Western blot结果。

总结

综上所述，与hESC-EVs相比，来自人视网膜祖细胞（hRPC）的胞外囊泡（hRPC-EVs）具有独特的蛋白质组成，在调节脂质代谢方面具有潜在作用。蛋白质组学分析揭示了hRPC-EV分泌过程中的选择性过程，导致独特的蛋白质货物富含与脂肪酸代谢相关的脂肪酸特异性转运蛋白和酶。在功能上，hRPC-EVs表现出降低视网膜色素上皮（RPE）细胞脂质过载细胞毒性的能力，通过调节脂肪酸代谢，这表现在延迟脂质沉积、逆转活性氧的产生以及整合到RPE细胞的线粒体网络中。

这些发现为开发针对脂质沉积型视网膜疾病（如年龄相关性黄斑变性（AMD））的新型治疗策略提供了巨大的希望。通过阐明hRPC-EVs的脂质调节机制，这项研究为视网膜退行性疾病的无细胞治疗方法的进步做出了贡献。此外，与hESC-EVs相比，hRPC-EVs独特的蛋白质组成和功能作用突显了利用胞外囊泡进行视网膜疾病特异性治疗应用时进行定制化方法的潜力。

参考信息

Extracellular vesicles from organoid-derived human retinal progenitor cells prevent lipid overload-induced retinal pigment epithelium injury by regulating fatty acid metabolism.J Extracell Vesicles. 2024 Jan;13(1):e12401. doi: 10.1002/jev2.12401.PMID: 38151470 PMCID: PMC10752800.

往期推荐

院士课题组发刊Bioactive Materials！首创衰老靶向SMSC类器官水凝胶，应用于骨性关节炎软骨缺损修复

Advanced Science | 以结直肠癌为例，比较PDO、PDX、PDOX不同类器官模型中的肿瘤进化和药物敏感性差异

从Matrigel到更多：一种通用ECM包埋类器官模型的免疫染色优化方案

【肺类器官-巨噬细胞共培养模型】间充质干细胞如何缓解脂多糖诱导的急性肺损伤

创新！构建皮肤类器官模型，模拟紫外线诱导的毛囊损伤

Cell Stem Cell | 利用【脊髓类器官】模型，阐明脊髓发育早期微环境对神经再生的作用

本文来源：类器官学社、盛合瑞生物