脉络丛肿瘤类器官揭示Wnt/β-catenin信号通路激活促瘤关键机制
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社
脉络丛肿瘤（CPT）是一种罕见的肿瘤，约占1岁以下儿童肿瘤的20%，恶性病例的5年生存率约为40%。CPT由于其罕见性和目前对脉络丛生物学的有限了解而被严重忽视。作为一种驱动基因未知的肿瘤，CPT的转化研究既缺乏病理学认识，又缺乏可靠的模型系统。这项多学科研究表明，Wnt/β-catenin信号的激活在CPT肿瘤发生中起重要作用，且通过敲除肿瘤抑制基因APC（腺瘤息肉病大肠杆菌）诱导了第一个CPT类器官的产生。该研究揭示了CPT的发病机制是一个关键发育通路失调的结果，并提供了一个基于人类细胞的体外3D模型，极大地促进CPT的基础研究和治疗开发。
文章介绍
题目：Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus
杂志：Neuro-Oncology
影响因子：IF=16.4
发表时间：2024年8月
#1
研究背景
Background
CPT基因组的特征是大量而频繁的染色体不稳定事件。据报道，在脉络丛癌中分别有高达50%和44.4%的体细胞和生殖细胞系发生TP53突变，在成人脉络丛乳头状瘤和不典型脉络丛乳头状瘤中有高达18%的TERT启动子突变，但大多数CPT，无论是儿童还是成人，都缺乏复发性的基因驱动突变。最近的体内研究表明，单独进行肿瘤抑制基因（如Tp53、Rb、Pten）敲除、原癌基因Notch1过表达或c-Myc过表达，或联合Tp53的缺失足以在小鼠中诱导CPT发生。由于遗传和转录组谱的相似性有限，仍然不确定这些模型中哪一个接近模拟人类CPT的生物学。因此，驱动人类CPT发病的机制在很大程度上仍未被探索。
儿童CPT主要是恶性的，这表明这些肿瘤可能是由于祖细胞发育过程中选择性通路的破坏和/或驱动局部微环境影响的细胞间相互作用的破坏而产生的。脉络丛上皮来源于顶板神经上皮增生的假层状祖细胞，控制其发展的明显候选者是由神经管组织中心区域分泌的信号分子，如BMPs和WNT配体。具体来说，端脑脉络丛来源于富含BMP/WNT/MSX的皮质边缘，而后脑脉络丛来源于WLS/MATH1/PAX6阳性的上菱唇。所有脉络丛祖细胞均高表达Rspo2-3基因，该基因编码Wnt/β-catenin信号R-spondins增强子。Wnt/β-连环蛋白通过经典的跨膜信号传导作用于质膜。Wnt配体由豪猪素(PORCN)棕榈酰化并自分泌或旁分泌方式发挥作用。分泌型Wnt配体与卷曲受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)共受体结合，诱导细胞质信号级联，从而稳定转录共激活因子β-catenin。这一事件与抑制含有APC和GSK3β的破坏复合体有关。
这项研究发现Wnt/β-catenin信号是CPT发生的关键调控通路。Wnt/β-catenin基因的生物信息学分析显示，人类CPT在基因组和转录组水平上都存在破坏。该研究证明，Wnt/β-catenin激活(i)诱导脉络丛细胞系的致癌特性，(ii)通过GSK3β抑制剂CHIR处理系统激活时，减少脉络丛类器官的分化，(iii)在APC消融下诱导脉络丛类器官的肿瘤形成。这些发现共同证明Wnt/β-catenin信号的激活对CPT的发生至关重要。
#2
研究关键点
Methods
1、对CPT患者的基因组和转录组数据进行多组学数据分析；
2、使用CRISPR-Cas9技术对体外培养的CPT细胞系进行基因编辑；
3、构建人诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的3D脉络丛类器官模型并进行APC基因敲除进行病理学研究。
#3
关键研究结果
Results
1、CPT患者携带与Wnt/β-catenin信号通路相关的多个基因组和转录组变化
为了确定参与ChP肿瘤发生的信号通路，该研究分析了为数不多的包含CPP和健康ChP对照的基因表达微阵列数据集之一。差异表达基因(DEGs)分析鉴定出7784个基因在CPP中表达量至少增加或减少两倍。IPA工具鉴定出“Wnt/p-catenin信号”是肿瘤中几个显著激活的通路之一。为了了解Wnt/β-catenin信号传导在CPT中是如何改变的，通过合并两个GO(“Canonical Wnt pathway”和“Regulation of Canonical Wnt”)生成一个GO列表Wnt2GOs，然后使用该基因列表对DEG列表进行子集化。结构发现450个具有统计学意义的基因，其中90个基因上调（括配体WNT2B、受体FZD2、正调节因子EGR139和反馈抑制剂WIF140），131个基因下调（包括APC、SFRP1、SOSTDC1、CYLD、SIAH1）。许多体细胞和种系SV位于Wnt/β-catenin信号基因的上游或下游，包括缺失、重复、倒置和易位。大多数SV的平均大小为1 Kb，其中一小部分可达100 Mb。大多数SV没有定位在基因上，但它们仍然发生在2 Kb – 5 Mb的距离内，含有可能的调控元件，从而可能影响Wnt/β-catenin通路基因的表达。
为了排除正常多态性，对次要等位基因频率采用< 1%的截断阈值，并在所有样本中鉴定出Wnt/β-catenin通路基因上的体细胞和种系SNV/Indels数量不同。我们发现了588个体细胞SNV/Indel变异，其中49.5%是新变异。68%的体细胞变异是内含子变异，其次是11%的非编码转录体变异。体细胞变异频率较高的基因包括CTNND2(80%)、FGF10(33.3%)，Wnt/β-catenin通路组分包括CDK14(46.67%)、GSK3β(33.3%)和LRP6(33.3%)。高种系变异频率的基因包括EGF(20%)，以及Wnt信号调节剂TCF7L1(33.3%)、WNK2(33.3%)、APC(20%)、DVL1(20%)、DVL2(20%)。WNT配体基因存在体细胞和/或种系变异，但频率较低(<20%)。据预测，LGR4、DVL3、LRP6、DKK2、WLS、APC和CTNNB1是人类基因组中可能发生的10%最有害的替换，这表明这些基因的变异体会破坏这些基因。最后，为了确定所鉴定的Wnt/β-catenin信号的遗传改变的相关性，计算了与Wnt/β-catenin信号和其他常见致癌途径相关的SNV/Indel变异的比例，发现Wnt/β-catenin信号在体细胞和种系变异中都是第二富集的途径（图1）。
图1 人脉络丛肿瘤中Wnt/β-catenin信号的转录组学和基因组学变化
2、Wnt/β-catenin信号在人CPT中激活
为了验证Wnt/β-catenin信号在CPT中的激活作用，对人肿瘤样本进行β-catenin (CTNNB1)染色，定性和定量分析显示，β-catenin在CPT细胞质和细胞核中的定位增加。通过β-catenin和TTR双染色证实β-catenin的细胞定位，结果与之前在人和犬CPTs中β-catenin染色一致，表明Wnt/β-catenin信号通路的激活增强。与这些观察结果一致，真正的Wnt/β-catenin靶基因AXIN2的mRNA表达和蛋白水平升高。Wnt/β-catenin信号负调控因子(如APC和SFRP1)的mRNA水平下调，而APC相关靶基因(如SP5和NOTUM)的mRNA水平上调。CPT样本中β-catenin蛋白水平升高，但未影响其mRNA水平。最后，测量了活化CTNNB1(未磷酸化的Ser37/Thr41)占总CTNNB1的比例，结果显示增加，特别是在CPP中。独立测量DVL2蛋白表达水平和磷酸化DVL2的比例也显示出增加，特别是在CPP中。由于人类CPC样本的可用性有限，DVL2和活化的CTNNB1蛋白分析仅在一个生物CPC样本中进行。以上数据表明Wnt/β-catenin通路在人类CPT样本中被激活（图2）。
图2 人脉络丛肿瘤显示Wnt/β-catenin信号通路的激活
为了研究CPT对Wnt/β-catenin信号通路的依赖性，使用PORCN抑制剂WNT974抑制人CPP细胞系HIBCPP中Wnt配体的分泌。WNT974以剂量依赖性的方式降低HIBCPP细胞活力。TOPFlash实验显示，HIBCPP细胞确实表现出自分泌的WNT信号，并且WNT974处理下调了WNT/β-catenin活性。此外，Wnt/β-catenin靶基因(AXIN2、MYC)和其他反馈调节因子(WIF1、DKK1)的mRNA表达也被WNT974降低。靶蛋白AXIN2和转录共激活因子CTNNB1的蛋白水平在药物治疗后下调，这导致克隆实验中的菌落数量显著减少。通过流式细胞术测量，WNT974还显著增加了G1期(G1阻断)的细胞百分比，减少了S期的细胞百分比。此外，药物治疗后结合EdU的细胞数量减少，表明自分泌WNT是HIBCPP细胞周期进展所必需的。使用Annexin V/PI染色进行细胞死亡分析，显示活细胞(AV-/PI-)减少，死亡细胞总体增加，但凋亡(AV+/PI-)未增加，进一步cleaved Caspase-3的免疫荧光染色证实了这一点（图3）。
图3 人脉络丛肿瘤细胞依赖于Wnt/β-catenin信号
3、Wnt/β-catenin信号的激活可诱导肿瘤发生
为了评估Wnt/β-catenin信号在ChP肿瘤发生中的作用，建立了Wnt信号激活的2D体外模型。APC是Wnt/β-catenin信号传导癌症的最重要驱动因素之一，在CPP中表达降低4倍。利用CRISPR/Cas9技术敲除永生性大鼠脉络膜上皮细胞系Z310细胞中的Apc基因，阻断了β-catenin破坏复合体的形成，从而组成性地激活了Wnt/β-catenin信号通路。选择3个独立的Apc敲除(Apc_KO)克隆进行分析。Apc_KO细胞系显示TOPFlash发光信号显著增加，超过外源性WNT3A处理的细胞水平。Axin2 mRNA水平在Apc_KO细胞中上调，且Western blot证实APC在所有克隆中均缺失，AXIN2和CTNNB1蛋白水平上调。Apc_KO细胞系细胞核中β-catenin积累，细胞质定位增加，进一步证实了Apc_KO细胞系中Wnt/β-catenin通路的激活。Apc_KO细胞能够形成更多的菌落，显示出更强的不依赖于锚定的生长能力，这是致癌转化的标志。接下来，使用优化的器官型脑切片侵袭试验评估Apc_KO细胞的侵袭能力，数据显示，Apc_KO球体从球体核心延伸出更多更长的突起，与对照组相比，显示出显著增加的侵袭能力。接下来，通过在Z310细胞系中过表达WNT3A配体(WNT3A OE)来激活Wnt/β-catenin信号，并选择3个独立的WNT3A_OE单克隆进行分析。与对照组相比，WNT3A_OE细胞的TOPFlash发光信号增加了3-5倍，并且对DKK1蛋白的WNT抑制有反应。与Apc_KO一样，WNT3A OE细胞显示AXIN2 mRNA和蛋白水平升高，TNNB1总蛋白水平显著升高。WNT3A_OE细胞抗β-catenin染色显示核积累。所有无性系均有增加菌落形成的趋势。当将WNT3A OE球体植入小鼠器官型脑切片时，也表现出增强的侵袭能力。尽管Apc_KO和WNT3A_OE这两种2D体外模型都旨在持续激活Wnt/β-catenin，但它们的功能读数和致瘤性特征在作用程度上略有不同。这可能是由于Wnt/β-catenin信号通路的激活幅度不同（图4）。
图4 Wnt/β-catenin信号激活诱导2D体外模型转化
4、Wnt/β-catenin通路的全身性过度激活导致脉络丛类器官分化减少
为了研究Wnt/β-catenin在具有更复杂时空组织的脉络丛3D模型中的激活，首先从hiPSC中生成了脉络丛类器官。为了评估Wnt/β-catenin信号激活增加对成熟hiPSC衍生脉络丛类器官的影响，我们用高剂量5 μm CHIR 99021 (CHIR，Wnt/β-catenin信号激活剂)治疗第40天至第60天的类器官。通过KI67染色发现CHIR处理的类器官在脉络丛上皮谱系标记物OTX2呈更大范围阳性，细胞密度和增殖率保持不变。相反，CHIR处理的类器官显示多个脉络丛分化标记物的蛋白表达降低，包括TTR、AQP1和KIR7.1。转录分析证实TTR、AQP1、HTR2C和CLIC6等多个分化标志物显著降低。相反，Wnt/β-catenin通路的基因显著上调，包括AXIN2、LEF1-a核效应因子和DKK1-a反馈调节因子。蛋白定量证实，在CHIR处理的类器官中，AXIN2和CTNNB1蛋白水平升高。CHIR处理的类器官未发现明显的肿瘤特征。综上所述，CHIR处理有效激活了脉络丛类器官中的Wnt/β-catenin通路，导致OTX2+ ChP谱系细胞分化程度较低（图5）。
图5 hiPSC衍生脉络丛类器官中Wnt/β-catenin通路的系统性激活
5、APC敲除足以诱导Wnt/β-catenin信号激活和脉络丛类器官的肿瘤形成
由于APC mRNA在人类肿瘤中的表达降低以及Apc_KO在脉络丛细胞系中诱导的致瘤性特征，该研究使用CRISPR-Cas9敲除脉络丛类器官中的APC基因。使用携带空载体Cas9-mCherry (sgEV)或sgRNACas9-mCherry (sgAPC)载体的慢病毒转导成熟的脉络丛类器官(第40-45天)以敲除APC，并保存至第60-65天，等待肿瘤生长。成熟阶段的基因工程引发了异质性改变，更好地模拟了肿瘤发生过程，并产生了嵌合脉络丛类器官，其正常脉络丛区域与肿瘤区域相邻。经转导的脉络丛上皮细胞(通常位于类器官周围)被证实为mCherry阳性。OTX2染色证实mCherry+区属于脉络丛谱系，Ki67染色显示细胞密度和细胞增殖增加。与人CPT一样，肿瘤脉络丛类器官TTR表达降低，主要含有单毛和非纤毛上皮细胞，这符合转化组织中纤毛缺失的特点，具有上皮转化和侵袭性增强的特点。组织病理学分析显示，在sgEV类器官中，KIR7.1 (CPTs的特异性致病标志物)在沿根尖边界信号强烈，细胞质表达很少。相比之下，sgAPC类器官的特征是在膜和细胞质区室都有强烈的KIR7.1表达。FAC分选的mCherry+细胞进行RT-qPCR，结果显示Wnt/β-catenin信号明显激活，多个已知成分的mRNA水平显著升高：靶基因(AXIN2、DKK1、MYC)，受体(LRP6)和效应物(CTNNB1、LEF1)。Western blot结果还显示，APC_KO细胞AXIN2和CTNNB1表达水平升高。这些数据证实了Wnt/β-catenin信号在sgAPC类器官细胞中的激活（图6）。
图6 APC缺失诱导hiPSC源性脉络丛类器官发生肿瘤。
小结
该研究发现，在人类CPTs中，涉及多个Wnt/β-catenin基因的基因组和转录组改变非常普遍，还证明CPT细胞依赖于Wnt/β-catenin信号，并且该途径的离散激活足以在2D模型和3D hiPSC衍生的ChP类器官中诱导肿瘤发生。总之，我们的数据表明Wnt/β-catenin信号的激活是CPT肿瘤发病的关键步骤。
参考文献
Hoa Ho K, Trapp M, Guida C, Ivanova EL, De Jaime-Soguero A, Jabali A, Thomas C, Salasova A, Bernatík O, Salio C, Horschitz S, Hasselblatt M, Sassoe-Pognetto M, Čajánek L, Ishikawa H, Schroten H, Schwerk C, Acebrón SP, Angel P, Koch P, Patrizi A. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 2024 Aug 31:noae176. doi: 10.1093/neuonc/noae176. Epub ahead of print. PMID: 39215664.
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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社