【高分综述】J Exp Med | 通过尖端技术重新发现人类胸腺
胸腺在我们生命的早期阶段发挥着至关重要的作用，它肩负着构建免疫系统的重任。它负责培养和筛选抵御外界侵扰的勇士——T细胞。但胸腺是如何完成这一艰巨任务的呢？
随着科技的飞速发展，我们重新定义对胸腺的认识。通过高分辨率成像技术，我们可以窥视胸腺内部的微观世界；借助单细胞组学，我们能够聆听每一个细胞的声音；而类器官培养技术，则让我们得以在实验室中重现胸腺的发育过程。这些尖端技术正逐步为我们描绘出一个前所未知的胸腺图景。
想要了解胸腺如何塑造我们的免疫系统？想知道科学家是如何利用这些前沿科技来探索胸腺的奥秘吗？本文将带你一探究竟。
文章介绍
题目：Rediscovering the human thymus through cutting-edge technologies
杂志：Journal of Experimental Medicine.
影响因子：IF=12.6
发表时间：2024年8月
#1
研究背景
Background
人类胸腺作为T细胞成熟与免疫耐受的关键枢纽，其结构与功能始终是免疫学领域探索的焦点。长久以来，受限于技术手段的局限，胸腺的复杂内在机制，尤其是其微观构造与细胞间错综复杂的交互作用，难以被全面洞悉。
早期研究主要依赖于组织学、免疫组织化学及流式细胞术等传统方法，这些方法虽成功揭示了胸腺的宏观结构轮廓，但在解析胸腺内部区域细胞异质性的深度上显得力不从心。此外，虽然小鼠模型为研究T细胞与基质细胞的发育路径提供了宝贵见解，但种属间的遗传差异、寿命差异及环境适应性差异，极大地限制了这些研究成果向人类生物学的直接转化。
随着单细胞组学、高分辨率成像及类器官培养等前沿技术的兴起，科研人员迎来了前所未有的机遇，得以深入探索人类胸腺的微观世界与细胞动态。这些技术使得能够识别和表征胸腺上皮细胞的新亚群，以及它们在T细胞发育和选择中的作用。
借助这些尖端技术，研究者们正致力于更精准地模拟胸腺的发育过程，解析胸腺功能障碍的根源，并为免疫缺陷疾病的治疗开辟全新的道路，为人类健康福祉贡献科技力量。
#2
研究结果
Results
1. 单细胞组学：深入到造血细胞组分的细节
1.1 胸腺前体细胞
多年来，鉴定人类胸腺前体细胞（TSP）及早期T细胞前体（ETP）一直是研究难点，主要由于胸腺祖细胞稀缺且缺乏明确标记物。Lavaert等人通过结合scRNA-seq和CITE-seq技术，从婴儿胸腺中分离出CD34+细胞，并识别出两种TSP亚型（TSP1和TSP2），它们基于CD7、CD10及归巢受体表达不同而区分。TSP1在Notch信号下分化为ETP，TSP2则类似Notch激活的TSP。Le等人也利用scRNA-seq揭示了胸腺中CD34+细胞的多谱系启动过程。Cordes等人进一步通过单细胞技术和功能测定，细分出TSP1、TSP2和TSP3三个祖细胞群，展示其不同的T细胞发育潜力。此外，这些研究还发现TSP能分化为浆细胞样树突状细胞（pDC），特别是TSP2在Notch和IFN-I信号下可能促进这一过程。最新研究显示，IRF8依赖性树突细胞（DC）前体细胞通过TNFR2信号促进T细胞前体产生，强调了DC在胸腺细胞发育中的关键作用（图1A 左）。
图1
1.2 胸腺细胞的发育
尽管对老鼠T细胞发育研究较多，但对人类的研究相对较少。为填补这一空白，Park等人通过scRNA测序，系统分析了胎儿、儿童及成年期人类胸腺样本，成功识别出50种不同的胸腺细胞亚群，涵盖了T细胞发育各阶段及多种免疫细胞类型。利用scTCR-seq技术，他们重建了T细胞分化过程，并揭示了与T细胞发育各阶段相关的新转录特征，同时提出了新的发育标志物如ST18、AQP3和TOX2。这项研究的主要成就在于鉴定了影响T细胞谱系分化的转录因子簇，但尚未直接关联转录因子表达变化与其功能活性。
1.3 激动剂T细胞发育
人类胸腺图谱项目及其后续研究（包括Park、Chopp、Morgana、Heimli等人的工作）深入探讨了CD4和CD8 SP T细胞成熟的发育轨迹及信号机制，特别是激动剂信号在Treg选择和诱导中的角色。研究发现，αβT(进入)阶段是T细胞激活转录特征显现的关键，标志着谱系规范的关键点，并可能分化为CD8αα命运或T(激动剂)轨迹。这些发现强调了CD4+和CD8+谱系承诺前发育时间点的重要性，且人类与小鼠在谱系承诺控制机制上存在进化差异。关于Treg前体群体，不同研究提出了不同的发育模型，凸显了胸腺T细胞个体发生的复杂性。此外，研究还探讨了CD4+CD8+ DP细胞在Treg诱导中的潜在作用，并提出了T(激动剂)和Treg(diff)作为成熟Treg细胞不同祖细胞类型的见解。这些研究为理解人类胸腺内免疫调节和耐受诱导的复杂性提供了重要基础（图1C 左）。
1.4 非常规T细胞
访问大型人类胸腺单细胞数据集可以更好地定义非常规T细胞的发育轨迹。scRNA-seq和TCR-seq的结合研究揭示了γδ T细胞发育的分化点及CD34+CD4+亚群作为其主要前体。这些γδ T细胞具有独特的基因表达和染色质景观。进一步研究显示，胎儿和儿童胸腺中的γδ T细胞亚群在效应类型和发育轨迹上存在差异，而成熟的Vγ9Vδ2 T细胞则表现出免疫应答的潜力。此外，研究还鉴定了一个多克隆的非常规T细胞(UTC)群体，这些细胞在早期DP阶段偏离传统谱系，并在胸腺和血液中表现出相似的发育轨迹及转录组学特征，包括自身反应性的TCR曲目（图1B 左）。
2. 基质细胞
历史上，胸腺研究多聚焦于易获取的造血细胞，而基质细胞研究则受限于组织学表征。胸腺基质主要由TECs、成纤维细胞、内皮细胞和间充质细胞构成。随着单细胞技术的兴起，现在有了更多机会探索这些基质细胞在人类中的异质性和功能。表2列出了识别不同基质细胞亚群的关键标记物（表2）。
表2
2.1 TEC祖细胞
Ragazzini等人在最新报告中，通过高分辨率的scRNA-seq、克隆扩增和分化试验，探索了人类出生后胸腺中的tec干细胞特性。他们鉴定了cTEC和mTEC的多个细胞簇，包括已知和新发现的亚群。他们发现了一组推测的上皮干细胞（PolyKRT），这些细胞表达编码细胞外基质(ECM)蛋白的基因，位于包膜下和血管周围空间，并在体外展现出干细胞特性和多系分化能力。
2.2 cTEC和mTEC的新子集
Park等人通过scrna测序，研究了胎儿、出生后早期及成人胸腺样本中的胸腺基质细胞，特别是tec的亚型。他们发现tec可以细分为多个亚型，其中mtec具有高度异质性，并成功鉴定了多种tec亚型。同时，他们在人类中发现了发现了一种罕见的类似簇状细胞的mTECIV群体并首次识别出两种新的EPCAM+细胞类型。
随后，Bautista及Campinoti等人的研究进一步推动了人类胸腺基质细胞的表征。Bautista团队发现tec是主要的基质细胞，但其他基质细胞类型也起关键作用。他们鉴定了cTEC和mTEC的不同群体，并揭示了未成熟TEC可能与胸腺退化和衰老有关。此外，通过合并数据集和计算分析，研究发现IGFBP5是胸腺退化的关键标志，也是诱导上皮细胞向间质转化(EMT)的特定调控的靶标。
Bautista及其同事的研究揭示了表达AIRE的TEC和MTEC其他亚群（如肌样细胞等）在耐受性诱导中的独特互补作用。AIRE+ TEC表达广泛的TSA，而其他MTEC则针对特定外周组织抗原。Park和Bautista的研究得到了Heimli等人的验证，后者还发现了新的NEURL2+ cTEC簇，与mcTECs相似度高。此外，研究发现不同TEC簇与胸腺细胞间的相互作用通过不同的趋化因子实现（图1D 左）。
2.3 非上皮间质细胞
近年来，胸腺非上皮间质细胞的重要性日益凸显。多项研究深入探讨了这些细胞的特征。Park等定义了两种成纤维细胞亚型，它们在胸腺发育过程中表现出不同模式。Bautista等发现间充质细胞表达与TEC发育和功能相关的多种关键因子。Heimli等通过鉴定四种簇状细胞增加了成纤维细胞亚群的复杂性，并鉴定了具有不同表达模式和功能的壁细胞亚群。所有研究均指出内皮细胞表达多种对胸腺细胞迁移至关重要的趋化因子和分子（图1E左）。
2.4 性别重要吗?
Stankiewicz的最新研究揭示了性别可能影响人类胸腺细胞的组成、转录谱及功能。他们分析了同龄（4个月）的男性和女性胸腺样本，发现性别间存在基因表达差异，女性细胞显示出与代谢，翻译和抗原呈递相关的基因表达水平较高，而男性细胞则增加了与脂肪生成，促炎信号，和ECM通路。此外，不同细胞类型中的性别特异性基因表达富集也有所不同，且男性和女性胸腺中的细胞类型丰度也有差异。研究还指出，性别差异可能影响胸腺内细胞间的相互作用及成纤维细胞的功能，如FGF信号和脂肪生成相关基因的表达。尽管这些发现为理解性别对胸腺发育和功能的影响提供了新视角，但由于样本量小且年龄单一，需更大规模、跨年龄的研究来进一步验证这些假设（图1B 右）。
3. 空间转录组和多重成像：位置很重要
虽然scRNA-seq提供了胸腺种群多样性的见解，但缺乏高分辨率空间系统限制了对其内部复杂细胞相互作用的深入理解。近年来，多维成像、空间转录组学结合单细胞转录组学的发展，增进了对胸腺生态位的认识。目前，基于10X Genomics Visium技术（55μm分辨率）的研究占据主导，但需通过反卷积方法解析斑点内的细胞转录谱。Suo等人和Heimli等人的研究，分别利用空间转录组学分析了产前多个器官及不同发育阶段胸腺的细胞定位，揭示了细胞类型、组织结构和基因表达模式，验证了反卷积方法的有效性，并确认了成纤维细胞亚群的多样性和功能。
Stankiewicz等人利用ATAC-Seq、CITE-seq和CODEX技术，结合分析，确定了HC周围的髓质区域，并确定了与负选择、交叉呈现和mTEC成熟有关的几个生态位。Yayon等人则通过更全面的方法，结合scRNA-seq、CITE-seq、scTCR-seq及多种空间技术，构建了人类胸腺从产前到产后的连续空间图谱。他们利用皮质-髓质轴(CMA)作为参照，将不同技术分析的细胞数据整合，揭示了T细胞发育的空间轨迹、细胞因子分布、细胞类型迁移与成熟等关键信息。研究发现，不同细胞因子在发育过程中具有不同的空间定位，细胞类型在胸腺中的分布也随发育阶段变化。此外，T细胞向CD8和CD4谱系发展的迁移模式存在差异，这与趋化因子受体的表达模式相关。连续CMA的生成提供了一个统一框架，有助于协调分析来自不同样本队列和技术的数据（表1、图1A、C、D、E 右）。
表1
4. 类器官系统：体外再造胸腺细胞
尽管技术进步推动了人类胸腺生物学的研究，但胸腺发育和功能的研究，特别是在病理条件下，仍面临挑战。由于胸腺组织获取有限及完全性胸腺障碍的复杂性，构建体外模型成为关键。近年来，胸腺上皮细胞和造血细胞祖细胞的体外分化方案，以及基于人类细胞的胸腺类器官技术取得了显著进展。Zuñiga-Pflücker小组开发的2D共培养技术广泛用于模拟T细胞发育，而Gay Crooks小组则创新性地开发了3D人工胸腺类器官（ATO）系统，该系统能更有效地从多种来源生成成熟T细胞，并展现出与体内胸腺细胞相似的转录代谢特征。MontelHagen等人还能够利用ATO协议将iPSCs分化为成熟的T细胞。最新研究显示iPSCs用CD19靶向CAR转导，然后在ATO平台上分化，可能会表现出T细胞分化从传统T细胞谱系向ILC2谱系的转移
ATO平台能够有效模拟来自已知与严重联合免疫缺陷相关的造血内在基因缺陷患者的CD34+细胞的体外缺陷T细胞发育。该系统不仅能用于病因诊断和治疗指导，还能表征新型T细胞缺陷、评估基因突变对T细胞分化的影响，并探索T细胞选择的细胞机制。ATO还被应用于评估造血祖细胞的T细胞分化能力及基因编辑疗法的临床前验证。尽管ATO具有多功能性和可靠性，但在将结果用于临床诊断时需谨慎，特别是在涉及晚期T细胞发育缺陷或特定基因缺陷（如ADA缺乏）时，ATO系统的局限性需被认识。
ATO是研究造血细胞自主缺陷导致T细胞发育问题的有效模型，但胸腺基质缺陷引起的T细胞问题需另寻方法。近年来，研究人员利用人类胚胎干细胞(hESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)分化为胸腺上皮祖细胞(TEPs)，以模拟胸腺基质缺陷。这些研究虽能识别特定遗传病的转录特征，但TEPs的完全成熟仍需体内移植。为克服此局限，研究者开发了胸腺类器官(TOs)，通过整合TEPs、造血祖细胞和间充质细胞，模拟胸腺复杂环境，支持TEC成熟及T细胞发育。此外，采用统计框架下的无偏多因子方法也成功生成了TEP，并通过优化方案实现了TEC的体外成熟，这些TEC能支持T细胞分化。最新研究还利用该方案探索了HOXA3在调节人类TEC分化中的作用。
综上所述，这些研究有助于确定人类先天性胸腺不全的病理生理学。此外，近年来在胸腺类器官生成的生物材料领域也取得了一些重要进展。合成及天然材料均被用于构建胸腺类器官，其中天然仿生材料如胶原蛋白和脱细胞基质展现出最优效果，尤其是脱细胞胸腺组织在移植实验中成果显著。然而，实现可移植胸腺类器官作为治疗手段还需优化细胞来源、生物材料选择及培养条件。未来，改进这些模型或能促进胸腺基质细胞和T细胞的体外生产，以达成治疗目标（表3、图2）。
表3
图2
#3
研究结论
Suggestion
胸腺不仅对T细胞的成熟至关重要，还参与了免疫耐受的形成，帮助我们的身体区分敌我。过去，由于技术限制，我们对胸腺的认识一直比较有限。但现在，借助高分辨率成像、单细胞组学和类器官培养等先进技术，我们得以深入探索胸腺的微观世界，揭示了其复杂的细胞构成和动态变化。
研究者们发现，胸腺中的上皮细胞和T细胞前体在发育过程中展现出惊人的异质性和精密的调控机制。这些发现不仅增进了我们对胸腺如何塑造T细胞库的理解，也为治疗免疫相关疾病提供了新的视角和策略。随着对胸腺功能更深入的认识，我们有望开发出更有效的免疫治疗方法，为患者带来福音。让我们一起期待，未来医学在胸腺研究的助力下，能够取得更多突破性进展。
参考文献
Pala F, Notarangelo LD, Bosticardo M. Rediscovering the human thymus through cutting-edge technologies. J Exp Med. 2024 Oct 7;221(10):e20230892. doi: 10.1084/jem.20230892. Epub 2024 Aug 21. PMID: 39167072.
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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社