Protocol：将诱导多能干细胞分化为结肠类器官的三步方案
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社
文章介绍
2024年8月，土耳其科研团队在期刊Methods in Molecular Biology上发表了一篇题为“A Three-Step Protocol to Differentiate iPSC into Colon Organoids”的文章，描述了将 hESC/iPSC 培养物分化成人结肠类器官的实验方案。
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摘要
Abstract
诱导多能干细胞(iPSC)作为胚胎干细胞(ESC)的一种普遍替代品，为再生治疗方法开辟新了领域。iPSC研究的进步促进了个性化细胞治疗研究、药物研究和疾病建模。虽然ESC和iPSC在分子和功能上存在差异，但已有研究证明iPSC可以作为再生医学的体外工具。利用 iPSC的领域之一是类器官。类器官是在体外3D制造的微型器官，模仿该器官的关键功能、结构和生物复杂性。类器官的应用不仅限于探索先天性疾病的发病机制，还包括对成年期个体因环境因素引起的疾病的建模和治疗。在研究癌变过程中结肠组织纤维化等疾病的分子机制和测试潜在药物方面，类器官发挥了关键作用。
将 hESC/iPSC 培养物分化成人结肠类器官的过程分为三个阶段，如图 1 所示。
图1 将hESC/iPSC培养物分化成人结肠类器官的过程分为三个阶段。该过程利用为每个阶段量身定制的培养基来生产人结肠类器官
结肠类器官形成的第一步是最终内胚层(DE)的分化。当从hESC或iPSC分化类器官时，必须通过使用生长因子和小分子来模拟胚胎发育过程。在本方案中，细胞的DE在最初的24小时内用CHI99021处理，并用Activin A+培养基培养细胞至少72小时。
结肠类器官形成的第二步涉及后肠分化，其中FGF信号通路起着重要作用。研究表明，FGF信号激活促进后内胚层形成，进而启动中肠与后肠的发育。联合FGF4与Wnt3a可维持后肠形态稳定，但高浓度FGF4结合干细胞分化支持因子（如B27）及CHIR99021，能在一周内将单层内胚层细胞转化为三维结构，自发形成早期结肠球体。CHIR99021与FGF4激活Wnt和FGF信号协同作用，完成后肠分化并诱导结肠球体形成。
最后阶段，早期结肠球体自发地从内胚层管状结构中分离出来，单层细胞被收集并嵌入Matrigel后，就过渡到了成熟过程。经评估后确定4天为后肠分化标准时长，但部分iPSC系在第5-6天出现自发球形芽出。分化末期，收集球体并嵌入Matrigel中，以高效获取结肠类器官。随后，培养基中添加EGF维持自我更新，CHIR99021与LDN193189等小分子则促进连续性与健康生长。
本方案以经济高效的方式，将iPSC成功分化为结肠类器官。
实验步骤
1 细胞培养与制备
1. 将人类诱导多能干细胞（iPSC）种到涂有 Vitronectin（Thermo Fisher）的六孔板上。
2. 使用Essential 8培养基（Thermo Fisher）作为培养基，37℃，5% CO2下培养。
3. 当iPSC达到80-90%汇合度时，就开始了最终的内胚层分化过程。
2. 最终内胚层分化
1. 在最终内胚层分化过程的第1天（第0天，图2a），将细胞的培养基更换为最终内胚层培养基Ⅰ。
2. 第2天（第1天，图2b），从培养基中移除 CHIR99021，换成最终内胚层培养基Ⅱ。第3天也使用相同的培养基。
3. 在3天的最终内胚层分化结束时（第2天，图2c），通过流式细胞术分析，证实CXCR4和CD117阳性细胞以及PDGFRa-细胞的比例超过了70%。这一证实标志着后肠分化过程的开始。
图2 最终内胚层分化的代表性图像。第0天，使用最终内胚层培养基Ⅰ将人类多能干细胞分化为最终内胚层（a）。第1天和第2天，培养基更换为最终内胚层培养基Ⅱ（b和c）。
3. 后肠分化
1. 从第4-7天（第3-6天），细胞在后肠内胚层培养基中培养。培养基每天更换。在4天的后肠内胚层分化过程中，应观察到细胞增殖率增加，并开始逐层形成网状结构。
2. 从第8天（第7天）开始，用结肠维持培养基取代基础培养基。在此阶段之后，结肠维持培养基作为常规培养基。每周更换三次培养基。
3. 在此阶段，细胞应开始变成CDX2+。在第3天和第7天，进行免疫荧光染色来检测CDX2表达的变化。
图3 第3天，使用后肠分化培养基开始后肠分化。后肠诱导24小时后（第4天），用10×（a）和20×（b）图像显示进展情况。第6天，观察到后肠球体的形成（c）。
4. 结肠分化和类器官形成
从第8天开始，预计到第20天，细胞将开始形成后肠球体。在这12天期间，每天对细胞进行监测至关重要。这是因为后肠球体会自发地从贴壁细胞层出芽。出芽的时间会因供体的不同而有所差异，而且会发生在不同的时间段。平均而言，在第12天到第16天之间会出现密集的出芽，但这一过程可持续到第20天。
1. 收集从贴壁细胞层中自发出芽的球体时，不要将其打碎。为尽量减少损失，在收集球体之前，用抗粘附溶液（StemCell Technologies）浸湿移液管吸头。在此阶段，球体可通过1000P移液器吸头。
2. 将后肠球体与培养基一起转移到预先用抗粘连溶液（StemCell Technologies）浸湿的15mL离心管中，静置约10分钟，使其沉淀在底部。此阶段不要使用离心机。
3. 球体沉淀后，小心地移除培养基，只留下管中的球体。
4. 根据球体的数量，在不产生气泡的情况下将其与40-100μL绝对Matrigel混合，然后以圆球形液滴的形式滴入Nunclon Delta Surface平板（Thermo Scientific）。Matrigel在室温下凝胶5分钟。然后，将其放入37 °C培养箱中再放置5分钟，以完成Matrigel凝胶化。
5. 在不影响Matrigel圆顶的情况下，将结肠维持培养基加入孔的一侧。另外，添加10μM Y-27632 （HY-10071, MedchemExpress）48小时。培养基每周更换两次。
6. 根据结肠类器官的生长速度，每周进行一次传代。传代时，使用冷DMEM/F12溶解Matrigel。将Matrigel圆顶从孔表面上取下，转移到预先用抗粘连溶液（StemCell Technologies）浸湿的15mL离心管中。
7. 用无菌剪刀剪开1000P移液器吸头，通过上下移动轻轻地将类器官打碎成小块。这一步骤可确保类器官仅因液体引起的波动而破碎。
8. 等待结肠类器官在底部沉淀约10分钟，然后移除所有培养基。
9. 按步骤4和5所述将结肠类器官包埋在Matrigel孔中，继续培养。
图 4 所示图像是结肠类器官维持过程的代表性图像。在此期间收集的后肠球体嵌入Matrigel并进行传代，以维持类器官的扩展。它们通常呈现球形形态，外层极化上皮细胞围绕着内层细胞团（D）。
5. 结肠类器官的特征
为了确定结肠类器官中存在的不同细胞类型，进行了免疫荧光染色。预计至少要经过四次传代，类器官内的细胞组织才能建立，其3D结构才能完全发育。对细胞类型的特定标记物进行染色，包括Chromogranin A、KLF5、FOXA2、Villin、lysozyme、LGR5和CDX2。
1. 在脱水阶段，将从培养基中收集的类器官放入30%的蔗糖溶液中，在4°C下培养过夜。
2. 将明胶溶液（将10g蔗糖和7.5g明胶加入100mL1× DPBS（Gibco）中）加热至37°C。
3. 从类器官中移除30%的蔗糖溶液，向类器官中加入明胶溶液，然后在37°C下孵育1小时。
4. 将包埋在明胶溶液中的类器官放入用于冷冻切片的模具中，并在添加无水乙醇的液氮中快速冷冻。随后，使用标准OCT对明胶包埋的类器官进行冷冻切片。随后，将样本保存在-80°C，直至切片。
5. 切片前，将样本在-25°C下平衡半小时，然后切取10μm厚的切片。
图 5 对肠类器官进行免疫细胞化学分析，以评估特定标记物的表达。在肠类器官中检测到了肠祖细胞标记物CDX2和肠隐窝标记物LGR5。刷状边界标记物Villin定位于肠类器官的基底侧表面，它们还表达成熟细胞类型的其他特征标记物，包括FOXA2（肠细胞）、Chromogranin A（肠内分泌细胞）、KLF5（基底隐窝上皮细胞）和溶菌酶（Paneth 细胞）。在P10时对冷冻切片的肠道类器官进行免疫荧光染色。
6 结肠类器官的冷冻和解冻
6.1 冷冻
1. 收集类器官，并按照传代前的方法让其沉淀。移除培养基。
2. 加入冷DMEM/F12，200×g离心5分钟。
3. 加入1mL CryoStor，在-80°C下逐渐冷冻。第二天，将其转移到液氮中。
6.2 解冻
1. 解冻类器官时，将冷冻瓶从液氮中取出，在37 °C的水浴中解冻约45秒。在完全解冻前将其从水浴中取出，并用酒精对其外部进行消毒
2. 将冷冻瓶中的类器官悬浮液转移到装有5mL DMEM/F12的15mL离心管中。200×g离心5分钟，使类器官沉淀。随后，将其嵌入Matrigel中继续培养。
材料
参考文献
Aksoy ZB, Akcali KC. A Three-Step Protocol to Differentiate iPSC into Colon Organoids. Methods Mol Biol. 2024;2835:59-67. doi: 10.1007/978-1-0716-3995-5_6. PMID: 39105906.
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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社