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• 模型：黑色素瘤C57BL/6J小鼠模型 （Mouse melanoma cell line 5555）

• 流式细胞仪：BD FACS Canto II

• 特点：无需酶消化法解离不同组织

肿瘤微环境相关知识点（讲座）：肿瘤微环境免疫抑制细胞研究

1.单细胞悬液制备

单细胞悬液制备对流式细胞术的重要性不言而喻。高质量的单细胞悬液是流式细胞术成功应用的基础和关键。不同组织的细胞和结构不同，因此需要建立切实可行的单细胞悬液制备方法，以确保流式细胞术的有效应用。

肿瘤组织：用显微镜载玻片的粗糙面机械地分解肿瘤组织，离心过滤。

NOTE: 这个方法不是很建议，一般会选择酶消化法来解离肿瘤组织和其他实体组织。如需刺激，最好percoll分离白细胞。

赛尔普组织解离常用方案如下（酶消化法）：

外周血（抗凝全血）：裂红，裂红时间5-10 min，不必裂成完全白色！！！

NOTE: 如若做功能性实验和需刺激类指标检测，需要分PBMC! 表面marker裂红即可。

骨髓：分离小鼠股骨胫骨，注射器吹出骨髓，裂红。

脾脏：研磨+裂红。

当然，我们也可以为您提供高质量样本制备方案和服务，目前赛尔普样本制备承接服务如下：

三、流式细胞仪

赛尔普流式细胞仪BD canto，三激光十色。

我们会从方案的确定、marker的选择、panel配色、对照设置、预实验等多个环节为您的实验保驾护航。

三、流式染色

Panel 1膜表面染色： T细胞、B细胞、MDSC细胞和巨噬细胞

Panel 2胞内染色： Treg细胞和巨噬细胞

四、结果分析

• T细胞和巨噬细胞

A:

1. CD4+辅助T细胞(CD4+/CD8-)

2. CD8+细胞毒性T细胞(CD4-/CD8+)

3. Treg细胞(CD4+/foxp3+/CD8-)

B-C：

1. 单核细胞 (CD11b+/Ly6C + Ly6G–)

2. TAMs (CD11b+/Ly6G−/F4/80+)：

3. TAM M1 (CD11b+/Ly6G−/F4/80+/MHCII+/CD206- or CD11b+/Ly6G−/F4/80+/iNOS+)

4. TAM M2(CD11b+/Ly6G−/F4/80+/MHCII-/CD206+ or CD11b+/Ly6G−/F4/80+/Arg+)

• MDSC细胞

1. M-MDSC (CD11b+/Ly6C+/Ly6G-/Galectin+)

2. PM-MDSC (CD11b+/Ly6C+/mild, Ly6G+/Galectin low)

• B细胞

1. classify B cells (CD45+/CD19+/B220+)

2. plasmatic B cells (CD45+/CD19+/B220+/CD138+/CD38-)

3. memory B cells (CD45+/CD19+/B220+/CD138-/CD38+)

参考文献

Sisó P, de la Rosa I, Ríos C, et al. Protocol to characterize the melanoma tumor immune microenvironment in mice from single cell to flow cytometry analysis. STAR Protoc. 2023;4(4):102690. doi:10.1016/j.xpro.2023.102690

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