中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的精准检测新方法
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人体免疫系统中中性粒细胞扮演着至关重要的角色。下文中开发了一种7标记物的流式细胞术方案识别外周血中性粒细胞的NETosis（中性粒细胞胞外陷阱的形成），用于分析外周血中性粒细胞的NETosis，能够区分NETotic细胞与坏死细胞，为NETs的量化提供了一种新的、更准确的工具，提高了NETs检测的特异性和准确性。。研究发现，在体外刺激和炎症条件下，所有检测到的NETotic中性粒细胞也表达citrullinated histone H3 (H3cit)。这项研究不仅推动了对中性粒细胞功能的理解，也为炎症性疾病的临床诊断和治疗提供了新的科学依据。
一、方案内容
7色方案用于分析中性粒细胞。这些标记物包括：
·CD15 和 CD66b：作为中性粒细胞的标记。
·MPO（Myeloperoxidase） 和 NE（Neutrophil Elastase）：这两种蛋白是NETs的组成部分，用于识别NETotic事件。
·H3cit（Citrullinated Histone H3）：某些类型的NETosis诱导后，H3cit会被表达，可以作为PAD4（肽酰基精氨酸脱酰化酶4）依赖性NETosis的标记。
·7-AAD：一种DNA染料，用于识别细胞外DNA，这是NETs的一个关键特征。
·Zombie NIR：一种胺反应性染料，用于排除坏死细胞，因为坏死细胞的细胞膜是可渗入的。
二、关键步骤和标准
1.排除坏死细胞：使用Zombie NIR染料来识别坏死细胞（Zombie-NIR+7-AAD+），并将其从分析中排除。
2.NETotic中性粒细胞的标记：中性粒细胞如果表达7-AAD（表明有DNA的存在）并且Zombie NIR弱表达（Zombie-NIRdim7-AAD+），则表明这些细胞具有附着的DNA，这是NETs的特征。
3.NET-associated蛋白质的共表达：通过检测MPO和NE的存在来识别NET事件（SSChighFSChighCD15+CD66b+Zombie NIRdim7-AAD+MPO+NE+）。
4.H3cit的表达：研究显示NETotic中性粒细胞也表达H3cit，可以作为PAD4依赖性NETosis的标记。
5.体外刺激：使用已知的NET诱导剂，如PMA 或ionomycin，进行体外刺激，以诱导NETosis。
6.DNase处理：通过DNase处理可以减少NET+中性粒细胞的比例，这验证了检测板对细胞外DNA的特异性识别能力。
7.炎症条件下的检测：研究还表明，在慢性和急性炎症条件下，可以在外周血液中检测到NET+中性粒细胞。通过这些方法，研究者能够更准确地识别和量化NETosis，这对于理解中性粒细胞在疾病中的作用至关重要。
三、代表数据
图1. 展示了使用流式细胞术识别NET+中性粒细胞的策略，其中PMA浓度与NETosis活性呈现剂量依赖性关系。
图2. 通过DNase处理显著减少了NET+中性粒细胞的比例，证实了方案对细胞外DNA的特异性识别能力。
图3. 数据表明，在急性心肌梗死（AMI）患者和稳定型冠状动脉疾病（CAD）患者中可以检测到NET+中性粒细胞，且AMI患者的NET负担显著高于稳定型CAD患者。这些发现对于理解NETs在心血管疾病中的作用具有重要意义，并可能有助于开发新的诊断和治疗策略。
四、实验提示与注意事项
·实验中特别注意避免使用可能诱导人工NETosis的PMA等刺激物。
·为确保结果的准确性，实验采用了优化的染色方案，减少了细胞洗涤步骤。
·实验操作中，保持细胞在冰上并及时分析，以减少细胞自发的NETosis。
·采用固定剂，以保持细胞结构的完整性。
总结与展望
这项创新研究不仅为NETs的研究提供了新的工具，也为相关疾病的诊断和治疗开辟了新的道路。随着流式细胞术技术的不断进步，我们期待着未来在生物医学研究和临床实践中的更多创新应用。
Reference：https://doi.org/10.1002/cyto.a.24851
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平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity, MFI)是描述偶联抗体的信号强弱的一种方法。
我们在阅读文献时，一般看到的MFI有两种：Mean Fluorescence Intensity或Median Fluorescence Intensity。
除了Mean和Median，还有Mode和Geometric mean，又该如何选择呢？
Mean：平均值
Median：中位数
Mode：众数
Geometric mean：几何平均数
Mean
平均数是全部数据总和除以这组数据的个数，在流式数据分析中常应用于线性正态分布中。
优点：它具有优良的数学性质，是实际中应用最广泛的集中趋势测度值。
缺点：是易受数据极端值的影响，对于偏态分布的数据，均值的代表性较差。
Median
中位数是指将数据按大小顺序排列起来，形成一个数列，居于数列中间位置的那个数，左右各有50%数据。
优点：不受数据极端值的影响，对于具有偏态分布的数据，中位数的代表性要比平均值好。中位数能揭示平均值掩盖的真相。是流式里面用的比较多的一个统计值。
Mode
众数是一组数据中出现次数最多的那个数。众数是一组数据分布的峰值，是一种位置代表值。
优点：易于理解，不受极端值的影响。
缺点：具有不唯一性，对于一组数据可能有一个众数，也可能有两个或多个众数。用的比较少。
Geometric mean
几何平均数是指n个观察值连乘积的n次方根，在流式数据分析中常应用于对数正态分布中。几何平均数受极端值的影响较算术平均数（平均值）小。
代表流式实验为一些普遍蛋白表达类的结果，例如一些在细胞上全部表达的蛋白指标，当然这种情况相对少一些。
添加 MFI操作方法
目标荧光通道的上一个门，鼠标右键选择add statistic 或者使用快捷键ctrl+B；然后选择想要分析的 PE-A，点击 Add 可以使其 MFI 在Σ Statistion 框中显示。
小结：
在标准的正态分布下，Mean= Median= Mode。
但是通常在流式中因为总会出现异常值(异常高或异常低的值)，不是完美的正态分布，而Median不受数据形态分布的影响，不需要是正态分布，所以流式数据分析时使用Median，以降低异常值对整个数据的影响。
对于分群明显的样本，使用百分比将产生更容易解释和更具有统计学意义的数据。
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