宝子们,生科人实验互帮互助微信群建好了!WB、流式细胞术、PCR、免疫组化/荧光、Elisa...
流式细胞术常见的样本类型
Ø 流体样本的处理和保存
1、外周血样本
√ 处理方法:采集新鲜样本与抗凝剂充分混匀,注明样本采集日期和时间。
√ 保存方法和时长:室温:乙二胺四乙酸二钾可稳定保存12~24 h;枸橼酸葡萄糖液可稳定保存72 h;肝素钠抗凝剂可稳定保存48 h
√ 注意事项:若白细胞计数、白细胞分类与流式细胞术检测共用同一管样本,应选择乙二胺四乙酸二钾作为抗凝剂。
√ 应用:血液疾病的免疫分型检测;白细胞计数;白细胞形态学染色和分类。
2、人骨髓样本
√ 处理方法:新鲜样本采集后置于肝素钠抗凝剂中。
√ 保存方法和时长:正常样本T细胞检测,室温肝素钠抗凝保存48 h;B细胞检测4℃保存72 h;单核及髓系表型检测4℃环境下可保存48 h;高分化淋巴瘤样本检测建议采集后立即检测。
√ 注意事项:不宜采用其他抗凝剂,因骨髓穿刺液样本与枸橼酸葡萄糖液的比例不是最佳时易导致PH值的改变,从而降低细胞的活性。
√ 应用:免疫系统疾病的表型分析;形态学染色分析。
3、小鼠骨髓样本
√ 处理方法:1~2mL注射器吹打成单细胞悬液,裂解红细胞后,重悬于无菌RPMI培养液等组织培养介质中。
√ 保存方法和时长:活细胞:单细胞悬液使用染色缓冲液4℃可保存24 h;固定细胞:采用4%的多聚甲醛溶液室温固定30 min,离心洗涤,1%甲醛的磷酸缓冲液重悬细胞沉淀,4℃保存1周。
√ 注意事项:冰上裂解红细胞,红细胞裂解时长不超过1 min;固定后的细胞使用1%甲醛或多聚甲醛缓冲液重悬时,该缓冲液应现配现用。
√ 应用:细胞分选;体外培养和扩增;免疫学相关研究;骨髓免疫细胞表型分析。
4、胸水、腹水、脑脊液样本
√ 处理方法:标准化操作收集样本,胸水、腹水样本可选用肝素钠、乙二胺四乙酸二钾、枸橼酸葡萄糖液作为抗凝剂;脑脊液使用Transfix等培养基或转运基质。
√ 保存方法和时长:胸/腹水样本4℃环境下可保存24 h;脑脊液4℃可保存24~48 h。
√ 注意事项:选用枸橼酸葡萄糖液抗凝剂过夜保存的样本细胞较弱、活性较低,注意其和抗凝剂保持合适比例;脑脊液不适用任何抗凝剂。
√ 应用:免疫系统疾病的表型分析;形态学染色分析。
5、体外培养的细胞系
√ 处理方法:悬浮细胞直接收集;贴壁细胞酶消化后收集。
立即检测
√ 保存方法和时长:室温3 h内处理。
√ 注意事项:针对不同的检测方法选用合适的缓冲液,避免一些金属离子的干扰。
√ 应用:活细胞AnnexinV凋亡检测;细胞死活分析;细胞表型分析等。
固定后保存
√ 保存方法和时长:TUNEL流式固定液室温固定60 min后,离心洗涤,再使用90%FBS+10%DMSO冻存,可稳定保存2个月。
√ 注意事项:细胞固定要充分;冻存细胞注意梯度降温。
√ 应用:TUNEL流式检测;耐固定表型抗体检测等。
固定后保存
√ 保存方法和时长:固定后保存:70%冰乙醇-20℃固定保存1周。
√ 注意事项:细胞沉淀使用PBS重悬,加入-20℃预冷的无水乙醇至终浓度为70%,加固定液的过程注意边加边混匀,避免细胞凝集聚团。
√ 应用:细胞周期检测;DNA探针检测等。
Ø 实体样本的处理和保存
1、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、脑组织、肺脏、胃肠等硬度较小组织
√ 处理方法:筛网研磨法处理;酶消化法处理。
√ 保存方法和时长:活体组织:组织培养基浸泡,4℃可保存24~48 h;置于0.9%氯化钠溶液中,4℃环境下可保存24 h。单细胞悬液:细胞沉淀使用HBSS缓冲液(含钙镁离子)或者全培养基重悬4℃可保存24 h;固定细胞:制备成单细胞悬液后,采用4%的多聚甲醛溶液室温固定30 min,离心洗涤,1%甲醛的磷酸缓冲液重悬细胞沉淀,4℃保存1周。
√ 注意事项:研磨组织注意筛网浸入培养基中,采用较软的乳胶棒或者注射器活塞端进行研磨,避免细胞物理损伤;酶消化法注意细胞勿消化过度;酶消化后及时加入HBSS缓冲液(含钙镁离子)进行终止消化和离心洗涤,含钙镁离子的缓冲液有助于维持细胞的活力 。
√ 应用:细胞分选;免疫细胞表性分析;免疫细胞细胞因子分泌功能检测等。
2、淋巴结、软骨、实体肿瘤等硬度较大的组织
√ 处理方法:酶消化法。
√ 保存方法和时长:活体组织:组织培养基浸泡,4℃可保存24~48 h;置于0.9%氯化钠溶液中,4℃环境下可保存24 h。单细胞悬液:细胞沉淀使用HBSS缓冲液(含钙镁离子)或者全培养基重悬4℃可保存24 h;固定细胞:制备成单细胞悬液后,采用4%的多聚甲醛溶液室温固定30 min,离心洗涤,1%甲醛的磷酸缓冲液重悬细胞沉淀,4℃保存1周。
√ 注意事项:不易采用研磨法处理硬度较大的组织,会导致细胞破碎;酶消化法的注意事项同上。
√ 应用:细胞分选;免疫细胞表性分析;免疫细胞细胞因子分泌功能检测等。
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