把“铁死亡+自噬”打在公屏上，跟着暨南大学团队还愁没文章?

各位小伙伴们，大家好呀！想必关注小薇的小伙伴都看过刘谦的魔术，去年春晚《守岁共此时》还历历在目，你的扑克牌有没有对上呢？但最近有个不幸地消息，刘谦被诊断患有肺腺癌，还好处于早期，希望他能早日康复！下面和小薇一起来看一下肺癌的最新研究吧！这篇文章将纳米药物用于治疗肿瘤，并且结合了国自然热点“铁死亡和自噬”，快来一起学习吧~

1.多种方法进行验证：研究通过细胞毒性的测定、活/死细胞染色试验、检测线粒体膜电位（MMP）、测定ROS、评估LPO、测定GPX4、CoQ10和MDA含量、评估线粒体的形态变化、DiD膜染色、观察细胞形态、检测MDC、mCherry-GFP-LC3B转染、建立肿瘤模型、苏木精和伊红（H&E）染色、Ki67染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色、GPX4和LC3B的免疫组化染色、血液检测等方法研究FP@SFN的体外抗癌效果，铁死亡-自噬协同细胞死亡机制和FP@SFN的体内药效学及生物安全性。

2.具有临床意义：体内和体外研究均表明，FP@SFN可以有效消除A549细胞并抑制皮下肺癌肿瘤。铁死亡和自噬被确定为主要的细胞死亡途径，FP@SFN通过这些途径增加氧化应激并促进细胞膜破裂。FP@SFN可以通过铁死亡-自噬协同机制有效增强铁死亡治疗肺癌的治疗效果，有利于未来的临床转化。

PS：课题方向是纳米药物和肿瘤的小伙伴，不要再犹豫了，快来联系小薇，小薇会为你提供个性化指导，有你想要的实验思路和生信分析，毕业和发文章都不是事儿！    

题目：具有铁死亡-自噬协同作用的丝素纳米破坏剂对肺癌治疗有效

杂志：International Journal Of Pharmaceutics

影响因子：IF=5.3

发表时间：2024年8月

公众号后台回复“123”，即可领取原文，文献编号：20240902

研究背景

肺癌化疗药物常常导致细胞产生凋亡抗性，从而导致治疗效果不理想。FIN56可诱导非凋亡性细胞死亡，即铁死亡，从而成为一种潜在的肺癌治疗方法。然而，FIN56诱导的铁死亡治疗存在一个瓶颈，具体来说，FIN56不能诱导足够的氧化应激，甚至可能触发针对铁死亡的防御系统，导致治疗效果不佳。

研究思路    

研究结果

1.均匀粒度和标准化分布

通过溶剂-超声方法合成SFN（图1A）。研究还合成了F@SFN、P@SFN和FP@SFN。其中，F@SFN的流体动力学直径为180.7±11.02纳米，PDI为0.289±0.001，Zeta电位为20.67±1.53毫伏。SFN的流体动力学直径为175.5±4.02纳米，PDI为0.250±0.016，Zeta电位为25.93±1.56毫伏。FP@SFN的流体动力学直径为193±5.86纳米，PDI为0.278±0.016，Zeta电位为–22.73±2.06毫伏(图1B、C和D)。TEM图像显示，四种类型的SEN具有均匀的球形形态（图1E）。粒径、PDI值、zeta电位的测定和TEM观察表明，所制备的SFN体系具有均匀的粒度和标准化的分散性，这有利于质量控制。此外，还检测到了SF的酰胺I、酰胺II和酰胺III的吸收峰。与SF溶液相比，各SFN组中的这些峰均向低波数移动，代表了SF典型的β折叠结构（图1G）。

图1：FP@SFN的制备和表征

2.体外抗肿瘤效果显著

使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）技术分析了C6@SFN的内化过程（图2A）。流式细胞术（FCM）显示，2小时和4小时的内吞率分别是1小时的1.98倍和3.64倍，表明C6@SFN被有效吸收并分布到细胞中。此外，细胞摄取具有时间依赖性，4小时的摄取量明显高于1小时（图2B）。对 A549 细胞进行了 F@SFN、P@SFN 和 FP@SFN 的CCK-8测定和活细胞和死细胞染色。在相同浓度的FNI56（约6μg/mL）下，FP@SFN与纯药组相比，细胞死亡率增加了25%，表明SFN增强了对肺癌细胞的杀伤作用（图2C、D）。用FP@SFN（6.25 μg/mL）和调节不同细胞死亡途径的抑制剂处理的A549细胞的细胞活力，结果显示，NAC的拯救效果最强；铁死亡和自噬抑制剂作用次之，提示铁死亡和自噬是细胞死亡的主要形式；Nec-1和Z-VAD-FMK对细胞无恢复作用，提示细胞死亡与坏死、凋亡无关（图2E）。综上所述，FP@SFN诱导的细胞死亡主要是由氧化应激引起的，以铁死亡和自噬为主要形式。    

图2：FP@SEN的体外抗癌能力

3.铁死亡引起的细胞损伤过程

使用生物透射电子显微镜（BIO-TEM）观察了线粒体的形态，FP@SFN引起线粒体结构发生显著变化（图3A）。线粒体的状态可以通过绿色/红色荧光的相对比例来评估，FP@SFN组主要观察到绿色荧光，提示线粒体膜电位明显降低，线粒体功能受损（图3B）。通过原子力显微镜（AFM）评估细胞肿胀程度和表面粗糙度（图3C）。结果表明，与对照组相比，FP@SFN组增加了表面粗糙度并诱导了细胞肿胀（图3D、E）。用DiD探针对细胞膜进行染色，检测其完整性。CLSM结果显示，经FP@SFN处理后，视野中没有完整的细胞，细胞膜被严重破坏(图3F)。使用生物扫描电子显微镜(BIO-SEM)观察细胞表面。图像显示，FP@SFN组中的细胞在其膜中有许多微孔，而对照组中没有，这进一步证实了膜完整性的损失(图3G)。    

图3：铁死亡引起的细胞损伤过程

4.铁死亡-自噬协同机制

首先利用DCFH-DA探针检测肿瘤细胞内ROS含量，FP@SFN能有效增强ROS相关的氧化应激水平（图4A）。然后利用C11-BODIPY探针测定LPO水平，FP@SFN组的LPO水平较高（图4B）。对于MDA测量，结果表明，在FP@SFN处理后，对照组的MDA水平增加了1.7倍（图4C）。这些结果共同表明，FP@SFN可以有效提高细胞内氧化应激水平。其次，对GPX4和CoQ10的表达进行分析。试剂盒检测显示，FP@SFN给药后GPX4和CoQ10分别下调至对照组的50.33％和61.65％，表明FP@SFN抑制了GPX4和CoQ10的水平（图4D、E）。此外，还测定了GSH的水平，结果显示FP@SFN使GSH下调至对照组的74.40％（图4F）。WB分析证实，用FP@SFN处理后，GPX4的表达下调（图4I、J）。第三，为了研究自噬的参与，进行了MDC染色以可视化自噬体，FP@SFN组显示出最多的绿色荧光，表明存在大量自噬空泡（图4G）。将AdPlus-mcherry-GFP-LC3B转染的A549细胞与SFNs一起孵育，检测自噬水平。在FP@SFN组和对照组之间，红色和绿色荧光强度的比率显著不同(P<0.001)，表明存在大量的自溶体，并且自噬进展到中期和晚期（图4H）。蛋白质印迹分析表明，FP@SFN导致自噬的标志蛋白LC3BII的显著上调（图4H、K）。

图4：铁死亡-自噬协同机制

5.增强铁死亡-自噬协同疗法对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

通过皮下注射A549细胞构建了皮下肿瘤模型，以评估体内抗肿瘤效果（图5A）。F@SFN和P@SFN组肿瘤体积总体波动较大，但FP@SFN组肿瘤生长抑制效果明显，提示铁死亡与自噬协同治疗在肿瘤治疗中具有较好的疗效（图5B、C）。FP@SFN组抑瘤率达72.47%，肿瘤重量降至对照组的29.76%，表明FP@SFN具有较好的治疗效果（图5D、E）。FP@SEN组的肿瘤生长速度比其他组慢得多，这表明它可能是一种有效的癌症治疗选择（图5F）。因此，FP@SFN具有抑制体内肿瘤增殖的作用。    

图5：增强铁死亡-自噬协同疗法对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

6.肿瘤切片的组织病理学分析

在对照组中，苏木精和伊红（H＆E）染色显示肿瘤细胞活性高且排列密集。然而，在FP@SFN组中，肿瘤组织侵袭受到抑制，表明纳米破坏剂具有令人满意的抗肿瘤效果（图6A）。随后，通过免疫组织化学和免疫荧光染色评估肿瘤组织。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）和Ki67染色显示，FP@SFN处理后，肿瘤增殖能力和细胞活力下降（图6B、C）。然后，通过GPX4和LC3B染色评估铁死亡和自噬机制，FIN56和PPL联合给药后，GPX4表达降低，LC3B表达升高。因此，FIN56可以有效抑制GPX4表达，而PPL可以激活LC3B表达（图6D、E）。总之，联合疗法诱导了铁死亡和自噬的协同抗肿瘤作用。    

图6：肿瘤切片的组织病理学分析

7.FP@SFN表现出良好的生物安全性

荷瘤小鼠在治疗过程中体重稳步增加，表明总体生物安全性良好（图7A）。主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾）的外观和H&E染色未发现显著的组织病理学变化，器官指数无显著差异，表明研制的SFN对主要器官是安全的（图7B、C）。血象检查显示纳米破坏剂的血液系统具有可接受的生物相容性（图7D）。总之，FP@SFN不会引起显著的全身毒性，可能满足临床应用的要求。    

图7：FP@SFN的生物安全性试验

文章小结

本文重点对FIN56与PPL共载SFN的制备及表征、体外抗癌效果、铁死亡-自噬协同细胞死亡机制、体内药效学及生物安全性等进行研究，提出的双药SFN对肺癌的临床治疗具有一定的价值。这篇文章将自噬、铁死亡和纳米结合起来，研究纳米药物和肿瘤的小伙伴们可以学习一下这篇文章的研究思路，有什么想法都可以告诉小薇哦，快来扫码联系小薇吧~