Plant Commun | 质谱成像联合单细胞转录解锁抗癌药物紫杉醇合成

红豆杉叶是紫杉醇的工业原料，紫杉醇是一种广泛用于治疗各种癌症的天然抗肿瘤药物。然而，红豆杉叶中紫杉烷类和其他活性成分的精确分布、生物合成和转录调控仍然未知。2023年9月11日，浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室王慧中团队在杂志Plant Communications上发表了题为“Mass spectrometry imaging and single-cell transcriptional profifiling reveal the tissue-specifific regulation of bioactive ingredient biosynthesis in  leaves”的研究论文，利用质谱成像技术结合单细胞转录组，绘制了活性次生代谢产物在红豆杉叶片中的可视化分布图，建立了红豆杉叶片单细胞水平上主要细胞类型的表达图谱。

1.红豆杉叶片的质谱成像及活性成分分布的可视化

采用timsTOF fleX MALDI-2检测红豆杉叶片中活性成分的积累模式（图1A-B）。所有被检测到的特征信号进一步分离为与不同已知叶片组织相关的4个主成分（PCs）：韧皮部和海绵叶肉细胞（SM，PC1）、表皮细胞（EP，PC2）、束鞘细胞（BS，PC3）和栅栏叶肉细胞（PM，PC4）（图1C）。使用热图显示所有特征信号的离子强度（图1D）。MeV聚类分析将所有特征信号分为六个聚类。簇I包含974个在PM细胞中高度积累的特征信号；簇II和III包含717和485个特征信号，在SM细胞中显著积累；簇IV包含411个特征信号，主要积累在EP细胞中；簇V主要包含636个特征信号在BS细胞中积累；簇VI包含283个特征信号在EP和BS细胞中高度积累（图1E）。

图1 timsTOF fleX MALDI-2质谱成像数据分析。

作者在红豆杉叶片中检测到了许多活性成分，包括杂环化合物、甾体、香豆素、酚类、萜类、糖苷类和紫杉烷类。对每个主要类别中的四种典型活性化合物进行了可视化（图2A）。黄酮类化合物银杏素、槲皮素和芦丁主要分布在EP细胞中，而(R)-光甘草定在四种组织细胞中均匀积累。甾体化合物20-羟基蜕皮甾酮、氢化可的松和坡那甾酮A主要分布在BS细胞中，而羊毛脂醇在BS和PM细胞中积累到高水平。四种选定的香豆素代谢物，香柑醇、coumestan、coumesterol和双羟香豆素，在EP细胞中检测到高水平，但在BS和PM细胞中很少。酚类化合物(-)棉酚和茶黄素仅在BS细胞中检测到；原花青素在SM和BS细胞中高水平积累，而xenognosin A在SM细胞中显著积累。萜类化合物鼠尾草酚、咖啡豆醇和 lactaroviolin 主要分布在SM细胞中，而角鲨烯主要分布在PM细胞中。糖苷类化合物chrysoeriol 7-O-neohesperidoside和三苄糖苷在PM细胞中积累到高水平，而毛地黃苷和假白藜芦碱在BS、SM和PM细胞中均积累。紫杉烷类化合物10-去乙酰紫杉醇-B、10-脱乙酰基紫杉醇、巴卡丁 III、和10-脱乙酰基巴卡丁 III主要在SM细胞中积累（图2B）。

图2 红豆杉叶片中活性成分分布的可视化。

2.红豆杉叶片的单细胞测序以及细胞类型标记和簇注释

分离叶片原生质体以产生单细胞（图3A），每毫升约分离出1500个原生质体。文库构建和scRNA-seq的基本实验流程如图3B所示。纯化的原生质体使用商业化的10x Chromium平台进行处理，使用UMI计数评估有效细胞的数量（图3C）。scRNA-seq数据来自8846个细胞，每个细胞平均有35874个reads和2352个基因（图3D）。细胞的t-SNE分布如图3E所示。将36808个基因的表达数据导入Seurat-Loupe软件，共鉴定出15552个富集基因簇。

基于富集簇的基因，所有细胞被分为15组细胞数量不均匀的簇。簇0包含最多的细胞（1180个细胞），而簇14包含最少的细胞（90个细胞）。每个簇细胞的t-SNE分布显示在补充图2C中。每个细胞簇的三个具有代表性的集群富集基因如图3F所示。

在模式植物叶片中已鉴定出多种细胞类型标记基因。通过序列比对，使用11个拟南芥叶片细胞类型标记基因来注释细胞类型：在束鞘细胞和维管细胞中特异性表达，在簇3中富集；和在叶肉细胞中特异性表达，在簇6和7中富集；和，在叶片气孔复合细胞中特异性表达，在簇8和12中富集；在维管束/原形成层细胞中特异性表达，在簇9中富集；在韧皮部细胞中特异性表达，在簇14中富集；在叶片保卫细胞中特异性表达，在簇8和12中富集；和在叶片表皮细胞中特异性表达，在簇12中富集；在叶片铺展细胞中特异性表达，在簇13中富集（图3G）。综上单细胞数据揭示了红豆杉叶片中细胞的高度异质性。

根据细胞类型标记基因，大多数细胞簇得到了注释。簇3包含木质部细胞和维管细胞；簇6和簇7包含叶片叶肉细胞；簇8和簇12包含叶片气孔复合细胞、保卫细胞和表皮细胞；簇9包含维管细胞和原形成层细胞；而簇13包含叶片铺展细胞（图3H）。

图3 红豆杉叶片单细胞数据分析。

3.红豆杉叶片紫杉醇生物合成的细胞类型特异性

据报道，许多关键酶参与在紫杉醇生物合成途径。单细胞RNA测序分析检测到了许多与紫杉醇生物合成相关的基因，包括三个基因、四个基因、四个基因、七个基因、四个基因、五个基因、六个基因、两个基因、一个基因、三个基因、三个基因、三个基因和一个基因（图4A）。为了确定关键基因，计算了基因表达的细胞覆盖率。在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（7.85%）；在T5OH基因中，在超过5%的细胞中表达（8.17%）；在基因中，具有最大的细胞覆盖率（5.37%）；在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（13.48%）；在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（5.51%）；在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（6.67%）；在基因中，具有最大的细胞覆盖率（12.47%）；在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（3.96%）；在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（22.48%）；在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（15.0%）；在基因中，显示出最大的细胞覆盖率（4.79%）（图4B）。

表达分析显示，大多数与紫杉醇生物合成相关的基因在叶肉细胞（簇6和簇7）中表达。然而，和的表达在木质部细胞和维管细胞（簇3）中被检测到（图4C）。UMAP可视化显示了12个主要的紫杉醇相关基因表达模式。为了揭示叶肉组织发育过程中的基因表达模式，计算了连续分化轨迹。拟时序分析有五个分支点，将所有细胞分为六个分支（图4D）。本研究数据表明，大多数与紫杉醇生物合成途径相关的基因，如和和，在成熟的叶肉细胞中表达。只有一个基因，，在幼嫩叶片的叶肉细胞中表达（图4E）。

图4 红豆杉叶片中紫杉醇生物合成的特异性细胞类型。

4.参与紫杉醇生物合成的主要细胞群

由于大多数紫杉醇生物合成相关基因都是在叶片叶肉细胞（簇6和7）中表达，因此将叶片中叶肉细胞重新聚类为A-D四个亚类。亚类A中有168个细胞，亚类B中有109个，亚类C中有103个，亚类D中有79个。大多数紫杉醇生物合成途径基因在亚类C和D的细胞中表达（图4F）。亚类A和B中的细胞与幼叶中叶肉组织相关，而亚类C和D中的细胞与成熟叶肉组织相关。因此，单细胞转录组数据表明，紫杉醇生物合成发生在簇6和7中的成熟叶肉细胞群，即亚类C和D中。将簇6和7中的基因进行GO和KEGG富集分析。两个与紫杉醇生物合成相关的术语GO条目，“紫杉烷代谢过程”和“紫杉烷14-β-羟基化酶活性”被显著富集。一个与萜类前体生物合成相关的KEGG通路，“萜类骨架生物合成”被显著富集。

5.CYP超家族的细胞特异性表达模式

作为经典紫杉醇生物合成途径的一部分，紫杉烷骨架的修饰需要CYP介导的氧化作用。基于公开的红豆杉基因组，共鉴定出487个CYP基因，包括CYP725亚家族的74个基因，主要在簇6/7中富集（图5A）。重新聚类分析显示，大多数CYP725亚家族的基因在簇6/7的C和D亚类细胞中表达。CYP725亚家族基因的表达模式与单细胞水平上紫杉醇生物合成相关基因的表达模式高度相似（图5B）。例如，和是簇7中特异的CYP725基因，为改善紫杉醇合成途径提供了几个候选基因（图5C和5D）。拟时序分析显示，大多数CYP725基因在叶肉组织发育的后期阶段均有表达（图5E）。

图5 CYP超家族基因的表达模式。

6.萜类和甾体代谢的细胞类型特异性

在萜类和甾体代谢方面，通过单细胞转录组测序鉴定出三个基因、两个基因、一个基因、三个基因、两个基因、四个基因、六个基因、一个基因、两个基因、一个基因和三个基因。和的表达在超过10%的细胞中被检测到。大多数萜类和甾体生物合成途径基因在簇6和7的细胞中表达。根据注释信息，萜类和甾体生物合成相关基因可能在叶片叶肉细胞中表达，一些萜类和甾体生物合成相关基因，如和，在幼叶叶肉组织中表达，而其他基因，如和，在成熟叶肉组织中表达。

7.酚酸和类黄酮代谢的细胞类型特异性

对于酚酸代谢，单细胞转录组检测到编码三种关键酶的基因，包括三个基因、九个基因和六个基因。在基因中，的细胞覆盖率最高（14.84%）；在基因中，的细胞覆盖率最高（2.78%）；在基因中，的细胞覆盖率最高（8.70%）。对于黄酮代谢，单细胞转录组检测到3个基因、8个基因、1个基因、2个基因和6个基因。在基因中，的细胞覆盖率最高（4.66%）；在基因中，显示了最大的细胞覆盖率（4.51%）；在基因中，的细胞覆盖率最高（6.01%）。表达分析表明，大多数酚酸和黄酮生物合成途径基因在簇8、11和12的细胞中表达。根据注释信息，酚酸和黄酮生物合成相关基因可能在叶片表皮细胞、气孔复合体细胞和保卫细胞。

8.参与次级代谢调控的细胞特异性TFs

尽管在红豆杉物种中已经鉴定出许多TF，但在单细胞水平上，次级代谢转录调控的信息是有限的。由于叶肉组织和叶片表皮组织是次生代谢的主要部位，因此 使用log（靶簇/其他簇）>0.26和P<0.01的标准选择了几个细胞簇特异性转录因子，包括6个基因、5个基因、4个基因、5种基因和7个基因。上述TF基因在所有注释簇中的表达模式如图6A所示。为了鉴定参与次生代谢的潜在转录因子，从公共的红豆杉基因组中提取了24个与紫杉烷生物合成相关基因、6个与酚酸生物合成相关基因、6个与黄酮代谢相关基因、13个与萜类生物合成相关基因以及5个与甾体生物合成相关基因的2000 bp启动子区域。在所有选定的启动子中，各种顺式作用元件的分布，如MBE、GT元件、W盒、ABRE和GCC盒如图6B所示。

使用相似的表达模式和匹配的结合元件这两个标准来筛选细胞特异性转录因子。在紫杉醇生物合成中，有两个基因（和），四个基因（和），三个基因（和），五个基因（和）和三个基因（）被确定为潜在的调节因子。此外，此外，预测有许多转录因子参与了各种次级代谢途径，其调控网络如图6C所示。

图6 参与红豆杉叶片次生代谢的细胞特异性TFs。

9.验证TFs与其潜在靶基因的结合

六种转录因子，包括和，被随机选择用来验证细胞特异性转录因子与其靶位点的结合。这六个转录因子基因的全长序列被克隆并插入到载体中。EMSA结果显示，直接与启动子中的MBE元件结合，直接与启动子中的W盒结合，直接与启动子中的W盒结合，直接与启动子中的GCC盒结合，直接与启动子中的GT元件结合，直接与启动子中的ABRE元件结合（图7A–7F）。为了确定和的转录活性，使用烟草瞬时表达系统进行了双荧光素酶报告分析（图7G）。结果显示，和显著激活了它们下游靶基因（分别为和）的表达，而和显著抑制了它们下游靶基因（分别为和）的表达（图7H）。

图7 TF与潜在靶标基因的验证。

本研究采用基质辅助激光解吸/电离质谱成像联合单细胞转录组测序技术，对红豆杉叶片切片上的各种次生代谢产物进行可视化，证实了不同活性代谢物的组织特异性积累，并创建了第一个红豆杉叶片代谢单细胞转录图谱，揭示了几个次级代谢途径的时空表达模式。根据细胞类型注释，大多数紫杉醇生物合成基因主要在叶肉细胞中表达；酚酸和类黄酮生物合成基因在叶表皮细胞（包括气孔复合细胞和保卫细胞）中高表达；萜类和甾体生物合成基因在叶肉细胞中特异性表达。研究人员鉴定出了许多参与次级代谢物生物合成新的、细胞特异性的转录因子，包括和。本研究以单细胞水平分辨率建立的红豆杉叶片中主要细胞类型的表达图谱，为研究细胞类型特异性调控次级代谢提供了有价值的资源。