细胞表型及检测方法盘点：增殖、凋亡、自噬、衰老、迁移和侵袭、血管形成、周期...

作者：科研根号三发布时间：2024-09-26

宝子们，生科人实验互帮互助微信群建好了！WB、流式细胞术、PCR、免疫组化/荧光、Elisa...

细胞表型是涉及基因和蛋白表达的多个细胞过程的集合体，可大体反应出目的基因的功能。在细胞内，将某目的基因敲除、敲降、过表达，建立稳转株后，与对照细胞一起，检测细胞表型。检测基因表达改变对细胞表型的影响，可推断该目的基因的功能。

细胞表型检测，检测的是如下若干表型：

增殖、凋亡、自噬、衰老、迁移、侵袭、血管形成、周期、泛素化、磷酸化、肿瘤耐药、EMT（上皮间充质转化）。

1、细胞增殖

细胞增殖的定义

细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。

单细胞生物：以细胞分裂的方式产生新的个体。

多细胞生物：以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。

细胞增殖的检测方法

1）对活细胞的代谢活性的检测：基于MTT、CCK-8等

2）DNA合成的检测：基于BrdU的免疫法或EdU的点击化学法，可通过体内成像、微孔板或流式细胞术检测等多种技术进行细胞示踪。

3）克隆形成

4）ATP含量测定

5）荧光探针检测：CFDA-SE和Calcein AM

6）分子水平检测：检测与增殖相关的分子标志物

1）细胞代谢活性检测

①MTT（噻唑蓝）

通过添加四咪唑盐到细胞中可进行线粒体内酶代谢活性的测定。活细胞能将四咪唑盐（如MTT、XTT、WST-1）还原成蓝紫色的甲瓒或甲瓒盐（Formazan），可通过分光光度计或酶标仪进行检测。MTT通常适用于贴壁细胞的检测，不适合悬浮细胞的检测。

②CCK-8（Cell Counting Kit–8）

CCK-8中的WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。基于CCK-8（WST-8）的试剂盒能高度准确地检测细胞增殖，比MTT法及XTT法的灵敏度高5倍，能检测更低的细胞数目。CCK-8可直接加入细胞样品中，因此适合悬浮细胞和贴壁细胞的检测。对细胞几乎没有毒性，检测完成后的细胞还可以继续培养使用。

2）DNA的合成的检测

DNA的新组装合成是细胞生长的必要条件，故经常被用来进行细胞增殖、细胞活力及凋亡的检测。 BrdU及EdU，都是胸腺嘧啶的非放射性类似物，能掺入增殖细胞的DNA中，可通过对BrdU及EdU的检测，从而对DNA的合成量进行测定。

①BrdU

能够代替正常的胸腺嘧啶参与细胞DNA复制过程，BrdU的特异性抗原可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。缺点是需要对双链DNA进行变性处理（酸变形、热变性等）。

②EdU

是BrdU的替代方法，无需特殊条件处理（酸解、热解等）。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

③3H-TdR

又称为放射性核素标记法，需要一定的设备（价格高昂），并且容易造成环境污染，需要特殊处理。胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，用同位素3H标记TdR后即可成功参与DNA合成代谢过程。通过测定细胞的放射性强度，来检测细胞的增殖情况。

3）克隆形成

在克隆内，细胞和细胞之间的连接比较紧密，一个细胞就能形成一个大的克隆。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

平皿克隆形成试验：适用于贴壁细胞，如正常细胞和肿瘤细胞；

软琼脂克隆形成试验：适用于肿瘤细胞、转化细胞和悬浮生长细胞；

不同的细胞克隆形成能力不同：

原代培养的细胞克隆形成能力弱，可传代的细胞系强。

二倍体细胞克隆形成能力弱，转化细胞系强；正常细胞弱，肿瘤细胞强。

克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）× 100%

4）ATP含量测定

死细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，ATP与活细胞数目具有良好的线性关系。当细胞死亡时，ATP会迅速水解，借助ATP依赖的荧光素酶（Luciferase）催化的萤火虫荧光素（Luciferin）发光反应测量其发光值，发光值与ATP量成正比。此方法适合高通量筛选检测。

5）荧光探针法

①CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）

是一种可穿透细胞膜的荧光染料。能够被动扩散进入细胞，其本身不具备荧光，直至被细胞内非特异性酯酶水解以产生荧光，它既可用于细胞示踪，也可用于细胞增殖检测。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通常用FITC通道检测。

②Calcein AM（钙黄绿素乙酰氧基甲酯）

增强的疏水性使其能够轻松穿过细胞膜，穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Calcein，从而被滞留在细胞内，发出强绿色荧光。Calcein AM的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。因此，Calcein AM是目前最理想的活细胞荧光探针之一。Calcein-AM常常与死细胞荧光探针PI（Propidium iodide）联合使用，检测细胞毒性和凋亡。

6）分子水平检测

在分子层面上，可以检测与增殖相关的分子标志物，常见的有三个PCNA，Ki-67和MCM。目前，在临床和科研工作中，应用最广泛的还是PCNA 和Ki-67。

2、细胞凋亡(apoptosis)

细胞凋亡（apoptosis）的定义

细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

特点：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。

细胞凋亡的检测方法

1）电子显微镜观察

2）Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测

3）细胞核染色-荧光染色法（Hoechst/DAPI）

4）DNA片段原位检测(Tunel)

5）膜变化检测（AnnexinV染色、膜电位、线粒体功能完整性分析检测）

6）分子水平检测：检测与凋亡相关的分子标志物

1）电子显微镜观察

胞浆浓缩，核糖体聚集在核膜周边呈新月状或环状小体。

胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由胞膜包裹的凋亡小体。凋亡小体内可含细胞浆、细胞器和核碎片，有的不含核碎片。

凋亡小体被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解。

2）Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

Annexin V可与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

3）细胞核染色-荧光染色法（Hoechst/DAPI）

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。细胞凋亡时，细胞膜通透性增强，染色质发生固缩，故经DNA特异性荧光染料染色后可快速检测细胞凋亡。

DNA 特异性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种染料与 DNA 的结合都是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

结果评判

Ⅰ 期：细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态

Ⅱa 期：细胞核的染色质高度凝聚、边缘化

Ⅱb 期：的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

4）DNA片段原位检测TUNEL

细胞凋亡中，染色体DNA双链/单链断裂二产生大量的粘性3‘-OH末端，在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3‘-OH端结合，经显色反应（细胞染成棕黄色）后检测DNA裂解点的技术。

左图为正常细胞，右图为凋亡细胞

5）线粒体膜电位检测

线粒体跨膜电位的下降也是凋亡细胞一个重要特点，是细胞凋亡过程中最早发生的事件(早于核形态的变化和PS的外翻)，膜电位下降被认为是凋亡最早的步骤。

在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物，可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。

6）分子水平检测

在凋亡过程中，有几种基因和蛋白起十分重要的作用，如BCL-2家族、Caspase家族、AIF等。可以用WB/IHC/IF等检测方法检测，从而检测细胞凋亡情况。

3、细胞自噬（Autophagy）

细胞自噬的定义

自噬（Autophagy）是普遍存在于真核细胞中的一种高度保守的代谢过程，是细胞内的一种“自食（Self-eating）”现象。它作为细胞内的主要降解途径，将胞内物质运输到溶酶体内降解。它主要有3种形式：巨自噬，微自噬和分子伴侣介导的自噬。

关于自噬更详细的解读可以阅读以下文章：

https：//mp.weixin.qq.com/s/ClYPSXSeATZfDkEW65Hpjw

细胞自噬的检测

1）透射电镜检测

2）双荧光穿梭质粒系统检测

3）单荧光质粒系统检测

4）分子水平检测：检测与自噬相关的分子标志物

1）透射电镜检测

自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。

2）双荧光穿梭质粒系统检测

自噬形成时，mRFP-GFP-LC3质粒转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。

当自噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光。

表达mRFP-GFP-LC3的小鼠胚胎成纤维细胞（左）接受饥饿处理（2小时），其中（右）或（中）不添加100 nM巴菲霉素A1（抑制自噬小体/溶酶体融合）。中间的黄色（自噬小体）和红色（自噬溶酶体）斑点都增加了，而右边的大多数斑点都是黄色的（自噬小体）

Ref： Following autophagy step by step 《BMC Biol》doi： 10.1186/1741-7007-9-39；

Methods in Mammalian Autophagy Research 《Cell》doi： 10.1016/j.cell.2010.01.028

3）单荧光质粒系统检测

利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：

无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；

自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

Ref： Autophagic flux disruption contributes to Ganoderma lucidum polysaccharide-induced apoptosis in human colorectal cancer cells via MAPK/ERK activation 《Cell Death Dis》 doi： 10.1038/s41419-019-1653-7

4）分子水平检测

LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。

LC3亚型有：LC3A、LC3B和LC3C。

LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。

在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。

自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用。

WB检测虽然是自噬最经典、公认的检测方法，但是在实际课题研究中，只有WB检测证明自噬的发生还不够。有条件建议增加其它检测方法进行证明。如果实验条件不允许，可以在实验分组中增加自噬的抑制剂、自噬的激动剂做拯救实验，正反证明自噬的发生。

4、细胞衰老（cell aging）

细胞衰老的定义

细胞衰老是细胞周期调控下多基因参与的复杂的生理病理过程，是一种抑癌机制，也是生物衰老的潜在原因之一。细胞衰老最显著的特征是细胞在很长一段时间内仍然维持代谢活性，但因阻滞于G1期，失去了对有丝分裂原的反应能力和合成DNA的能力，不能进入S期。衰老细胞有着显著的特性，衰老细胞细胞通常体积变大，表达pH 6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶。

细胞衰老不等同于细胞死亡，衰老的细胞在一段时间内仍保持代谢活性，也会出现一些明显的变化，具有典型的细胞周期停滞、衰老相关分泌表型、大分子损伤及代谢紊乱四个特征。

细胞衰老的检测方法

1）β-半乳糖苷酶试剂盒检测

2）流式细胞术（PI染色）检测细胞周期变化

3）分子水平检测：检测与衰老相关的分子标志物

1）β-半乳糖苷酶试剂盒检测

SA-β-gal试剂盒检测细胞衰老。以X-Gal为底物，通过细胞内SA β-gal在酸性条件下稳定表达，催化底物生成蓝色产物，表达SA-β-gal的细胞为阳性细胞，呈现蓝色，从而在光学显微镜下观察颜色变化以分析细胞的衰老状况。仅对衰老细胞进行染色，不会染色衰老前的细胞（presenescent cells）、静止期细胞（quiescent cells）、永生细胞（immortal cells）或肿瘤细胞。

2）流式细胞术（PI染色）检测细胞周期变化

细胞周期（cell cycle)：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S 期、G2期和M期组成。衰老的细胞阻滞于G1期，失去了对有丝分裂原的反应能力和合成DNA的能力，不能进入S 期。

PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与 DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

流式细胞周期结果图解读

纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；

横坐标DNA Content：即DNA含量；

G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；

S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大；

G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；

M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开。

3）分子水平检测

western blot与qPCR检测衰老相关基因(P16、P21、P53、SIRT1、PCNA)表达。

5、细胞迁移和侵袭

细胞迁移和侵袭的定义

①迁移：肿瘤细胞离开原发瘤，侵入淋巴管（或血管）→肿瘤细胞在淋巴管（或血管）内运行→肿瘤细胞从管中出来，再转移到其他淋巴结（或毛细血管）中→到达其他组织或器官

②侵袭：肿瘤细胞向器官表面靠拢→肿瘤细胞用伪足贴在表面与内皮细胞粘连→肿瘤细胞用伪足从细胞的天然间隙到达基底层→肿瘤细胞深入器官深部→形成癌巢搜索

细胞迁移和侵袭的检测方法

1）细胞划痕检测细胞迁移

2）Transwell检测细胞迁移和侵袭

1）细胞划痕检测细胞迁移

细胞划痕是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。

注意事项：一般做划痕实验，都是在无血清或者低血清状态下培养的，否则细胞增殖就不能忽略。

按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，这就解决了前后观察时位置不固定的问题。

2）Transwell检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。侵袭实验需铺Matrigel，而迁移实验不需要。

6、肿瘤血管形成

肿瘤血管生成的定义

血管生成是肿瘤发生过程中新血管的形成。它是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。

肿瘤血管形成检测方法

体外管形成实验方法

①内皮细胞增殖实验：内皮细胞活化增殖是血管生成的起始阶段。目前主要有两种测定细

胞增殖的方法，即净细胞数测定和细胞周期分析。

②内皮细胞迁移实验：细胞迁移是血管生成的必经阶段。目前检测细胞迁移能力的方法主

要有划痕愈合实验和 Transwell 细胞迁移实验。

③血管内皮细胞小管样结构形成实验 (Tube formation Assay)：小管形成实验能模拟人

体内毛细血管生成的过程, 包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤, 接近人

体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时能形成网

状结构。

7、细胞周期

细胞周期的定义

细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期（M期）两个阶段。间期又分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）和DNA合成后期（G2期），处于不同时期的细胞的DNA含量存在差异。

一般认为，G1期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环，是二倍体细胞；S期细胞，DNA含量逐渐增加，从二倍体变成四倍体，随后进入G2期，最终进入M期。检测细胞周期常用的方法是检测DNA含量，可以选择能与DNA结合的荧光染料（如PI），再根据细胞各个时期DNA含量不同从而荧光强度不同的方法，分析各个阶段的细胞比例。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

细胞周期反应了细胞增殖速度，单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

细胞周期的检测方法

1）流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测

2）同位素标记法

3）基于成像的荧光检测法

1）流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测

细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的 G0/G1期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

2）同位素标记法

标记有丝分裂百分率法 (PLM) 是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。

检测原理：

① 待测细胞经 3H- 胸腺嘧啶核苷标记后，所有 S 期细胞均被标记。

② S 期细胞经 G2 期才进入 M 期，所以一段时间内 PLM = 0。

③ 开始出现标记 M 期细胞时，表示处于 S 期最后阶段的细胞，已渡过 G2 期，所以从 PLM = 0 到出现 PLM 的时间间隔为 G2期的持续时间。

④ S 期细胞逐渐进入 M 期，PLM 上升，到达到最高点的时候说明来自处于 S 最后阶段的细胞，已完成 M，进入 G1 期。所以从开始出现 M 到 PLM 达到最高点 (≈ 100%) 的时间间隔就是 M 期的持续时间。

⑤ 当 PLM 开始下降时，表明处于 S 期最初阶段的细胞也已进入 M 期，所以出现 LM 到 PLM 又开始下降的一段时间等于 S 期的持续时间。

3）基于成像的荧光检测法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鉴别细胞处在细胞周期的哪一时期，因此可以用来研究癌症细胞周期的进程。FUCCI 技术建立在鉴定过表达的两种调节细胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上，其中 geminin 融合的是绿色荧光基团 AmCyan，而 Cdt1 融合的是红色荧光基团 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平随着细胞周期的变化而不断波动：Cdt1 蛋白水平在 G1 阶段达到峰值，而 geminin 蛋白水平在 S，G2 和 M 期不断升高。这一结果体现为表达 FUCCI 细胞核在G1 期为红色而在 S，G2 和 M 期则呈现绿色。

8、泛素化

泛素化定义

泛素是一种在真核生物中普遍存在的小分子（8.5KDa）调节蛋白，在人类基因组中，有四个基因编码泛素蛋白：UBB, UBC, UBA52 和 RPS27A。这些泛素蛋白结合到底物蛋白质分子的特定位点上的过程叫泛素化（Ubiquitination），而泛素分子被去除的过程叫去泛素化（Deubiquitination），泛素化与去泛素化是细胞内重要的与蛋白质特异性降解有关的生理过程，同时也是细胞信号途径中进行调节的重要方式。

泛素化过程通常由泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)介导。在泛素-蛋白酶体系统中含有多个关键的组分，包括：泛素、泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素蛋白连接酶(E3)、去泛素化酶(DUB)和蛋白酶体。

泛素化检测方法

1）高通量检测

2）IP-WB 法检测

3）UbiTest检测

1）高通量检测

蛋白分子在发生泛素化之后，蛋白的分子量会因为泛素化标记而变大。如果蛋白分子被一个

泛素标记，蛋白的分子量就变大了 114 Da；如果蛋白分子被两个泛素标记，那么蛋白的分

子量就变大了 114 Da x 2，也就是分子量变大了 228 Da。以此类推。通过质谱的方法，完全可以通过高通量的方式，检测出样品中蛋白被泛素化标记的情况。

2）IP-WB 法检测

通过免疫共沉淀方法将目标蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行 SDS 电泳和 western blot 分析。

3）UbiTest检测

先通过TUBEs富集纯化样本中的泛素化总蛋白，随后，将分离到的泛素化蛋白经或者不经去泛素化酶DUBs处理，（+）/（-）DUBs处理的蛋白样本用靶蛋白的特异性抗体进行免疫印迹（WB）分析，通过条带比对分析实现对泛素化蛋白的定性及半定量检测。

9、肿瘤耐药

肿瘤耐药定义

肿瘤耐药表型分为两大类：先天性耐药（natural resistance）/原发性耐药（Primary resistance）和获得性耐药（acquired resistance）/继发性耐药（Secondary resistance），而获得性耐药又可细分为原药耐药现象（PDR）和多药耐药现象（MDR）。

MDR是导致肿瘤患者化疗效果不理想甚至化疗失败的最主要原因之一。

化疗药物诱导敏感细胞株向耐药细胞株转化的方法可大体分为药物浓度递增法、大剂量冲击法、大剂量冲击结合浓度递增法、转基因结合药物筛选法、三维细胞培养法和化学诱变剂、射线照射法等 6 种。其中药物浓度递增法是体外诱导耐药细胞株最常用的方法，筛选建立的耐药细胞系的耐药性较为稳定和可靠。而化学诱变剂、射线照射法只是筛选耐药模型时，所采用的辅助方式，需要化疗药物的孵育，二者需要配合使用。

肿瘤多药耐药机制的认识和研究，除了来自体外细胞实验的研究成果，还得益于体内模型的建立。体内动物模型能更好地反映体内肿瘤耐药现象的形成情况。目前，多药耐药体内模型分为移植型和诱导型两种，最常用的实验动物是小鼠和大鼠。

肿瘤耐药检测方法

目前对细胞耐药能力检测的最常用方法是检测细胞的 IC50 (half maximal inhibitory concentration)。

IC50，是指某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的 50%量时的浓度。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡 50%，该浓度称为 50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，即细胞对药物的耐受程度越低。通过比较细胞样本的 IC50（可与敏感细胞或者亲本细胞比，也可与设计好的对照组比），即可评价该样本对药物的耐受能力。

10、磷酸化

磷酸化定义

蛋白质磷酸化是研究最充分的翻译后修饰（PTM），其中来自三磷酸腺苷（ATP）的磷酰基通过激酶共价连接到丝氨酸（~86%）、苏氨酸（~12%）或酪氨酸（~2%），并通过磷酸酶去除。其他氨基酸的磷酸化也有报道。磷酸化可以改变蛋白质的结构、功能和相互作用。

磷酸化在稳态和疾病的几乎所有细胞过程中起关键作用，包括信号转导、细胞周期、分化、增殖、代谢、运动和死亡。重要的是，不同残基的磷酸化可能导致不同的结果。例如，RAF 1是MAPK途径的中心激酶，当其在丝氨酸（S）或苏氨酸（T）残基S259、S338、S340/341、T491或S494处磷酸化时被激活。然而，S289/296/301处的磷酸化导致RAF 1激酶活性的抑制。了解磷酸化的具体位点和水平是至关重要的。

磷酸化检测方法

1）生物信息学方法

2）Western blot 方法

3）质谱技术

4）流式细胞术

5）其它方法：ELISA 、DS-PAGE、酶活性分析、NanoPro 1000 超微量蛋白分析系统

1）生物信息学方法（预测，作为参考手段）

蛋白质磷酸化位点的预测和识别，对蛋白质磷酸化的研究至关重要。一般情况下，如果你猜测蛋白可能发生磷酸化，那么它需要包含磷酸化的典型序列，在进行实验之前可以先利用网站进行蛋白磷酸化预测，根据预测结果开展相关实验验证目的蛋白是否真的发生了磷酸化。常用的磷酸化预测网站包括以下：

Uniprot：http：//www.uniprot.org/

GPS：http：//gps.biocuckoo.org/

macvector ：http：//macvector.com/

DTU Health Tech：https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/

phosphosite ：https：//www.phosphosite.org/staticUsingPhosphosite.action#

2）Western blot 方法

蛋白质免疫印迹法是定性测量蛋白质磷酸化水平的金标准。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，当施加电压时，蛋白质从凝胶转移到膜上。通过将识别目标蛋白质磷酸化的抗体添加到膜中。然后，磷酸化抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗结合。当添加HRP底物时，可以检测到抗体结合了磷酸化的蛋白质，从而产生化学发光。