流式分析、分选 | 常见各免疫细胞亚群的百分比+分选常见问题汇总

作者：科研根号三发布时间：2024-09-24

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一、常见各免疫细胞亚群的百分比

对于低含量的目的细胞，知道其大致比例，有助于确定流式分析、分选实验流程中的许多关键要素，如：

①需要染色的样本总量

②上流式时需要采集的细胞总数

③配色时染料的选择

④分选时纯度、得率、活性和时长的权衡

以下整理了人外周血、小鼠、大鼠各细胞亚群比例，在科研根号三公众号回复“实验13”可下载这些数据的EXCEL表格。

这些数值仅供参考（所有显示的百分比是每个样本中各细胞亚群占白细胞总数的百分比）。可能会因样品制备、个体差异和所用动物的品系而异。

表1-人外周血各细胞群比例

表2-小鼠各细胞群比例

表3-大鼠各细胞群比例

关于需要获取的事件数量，建议使用泊松统计，它定义了给定数量的事件将在固定的时间/空间间隔内发生的概率，假设这些事件将以已知的平均速率发生，与从先前事件经过的时间无关。对于流式的稀有细胞检测：N为总事件数，R为目标细胞如阳性细胞数，P为目标细胞比例，则为P = R / N，0≤P≤1。方差定义为：Var（R）= NP（1- P）。标准差SD是方差的平方根，CV是等于1/SD即1 /Var的平方根*100%。应用举例，如检测PBMC中的B细胞，健康个体中，CD19+B细胞比例为10％左右，因此：P = 0.1，N=5000时，计算得CV=4.71％，一般建议CV保持在5％以下，因此获得5 000个事件也已足够。若获取10000个总事件，则CV=3.33％。保持达到一定的CV值，目标细胞比例越低，需要获取的总事件数越多。

下图显示了特定细胞稀有度比例对应的变异系数（CV）值。CV与阳性事件的数量有关，并定义为标准偏差 /平均值。

通常，更低的CV代表更好的实验精确度和可重复性。使用此表，如果可以接受较宽的CV，则细胞比例为0.1％的10,000个事件就足够了。但是，CV为10％时需要100次阳性事件，现在您可以看到10,000个事件数只有当目标细胞比例在1％以上的范围内CV值才能达到比较好的状态（<5%）。对于非常稀有的细胞群体（万分之一乃至十万分之一），要达到10％的CV就需要收集100万甚至1000万个事件。若以每秒10,000个事件的速度进行收集，收集1000万个事件将花费1000秒即16分钟。

图3. 假设下游应用需要100,000个细胞，则此图表可以帮助您基于液滴频率和细胞群比例来确定分选所需的起始细胞数量及所要花费的时间。

细胞频率也是选择荧光基团时的一个因素。对于低密度抗原，建议选择明亮的荧光基团，但对于稀有细胞，也建议选择明亮的荧光团，因为阴性群体中的背景染色可能会掩盖其荧光。最后，在进行细胞分选实验时，细胞群的频率可能会影响分选。将需要有足够的起始材料来为下一次实验分选足够数量的细胞。此外，细胞频率也会影响收集足够细胞所需的时间；如果对细胞进行分选所需的时间过长，则可能需要降低纯度。