项目文章濒危药用植物冷层积过程中种子休眠至萌发的分子调控机制

桃儿七（(Royle) Ying）是一种濒危的多年生药用草本植物，其种子表现出形态生理休眠，需要低温层积才能发芽。然而，这种从休眠到发芽转变的精确分子机制尚不清楚。2024年9月，中国科学院西北高原生物学研究所在杂志plants上发表了题为“Metabolite and Transcriptomic Changes Reveal the Cold Stratification Process in  Seeds”的研究论文，本研究通过转录组和植物激素靶向代谢组相结合，揭示了桃儿七种子在低温层积过程中的复杂分子调控机制。迈维代谢为该研究提供了转录组和植物激素检测服务！

1.种子层积过程中的形态学和生理生化变化

在层积过程中，种子的胚胎形态和胚胎率发生了显著变化。在层积早期（0–45天），胚胎形态主要是球形的和鱼雷形的。然而，在层积后期（45–120天），鱼雷形和子叶形胚胎变得更加普遍。图1A（代表层积15天的种子形态）和图1B（代表层积90天的种子形态）展示了胚胎发育的显著变化，为层积过程中发生的重大转变提供了直观的说明。随着层积过程的进行，胚胎形态逐渐从球形和鱼雷形胚胎转变为子叶形胚胎，这是胚胎成熟的重要指标。这种转变表明大多数种子已经完成了生理后熟过程，具备了发芽的能力。种子的胚胎率总体呈上升趋势，在75–90天之间，胚胎率迅速增加，在90天时达到最大值37%。随着层积时间的延长，种子的发芽率总体呈上升趋势。层积30天后，休眠开始逐渐打破，种子发芽率显著增加，在层积90天后达到最大值47.8%（见图1C）。胚胎率和发芽率的持续增加表明，种子内部发生了一系列生理和生化反应，更多的种子完成了从休眠到准备发芽的转变。这种变化与和种子层积过程中观察到的变化一致。

图1D–F展示了种子在冷层积过程中的营养含量变化。种子中的淀粉含量总体呈现下降趋势，在0–60天和90–120天期间变化平稳，层积至90天后显著降低。与层积前的淀粉含量相比，90天时种子中的淀粉含量下降了53.5%。种子中的可溶性蛋白含量总体呈上升趋势，在早期层积期（0–60天）变化平稳。层积至90天后，种子中的可溶性蛋白含量显著增加。与层积前的可溶性蛋白含量相比，90天时种子中的可溶性蛋白含量增加了51.11%。种子中的可溶性糖含量呈上升趋势，在0–90天期间变化相对平稳，在120天时达到最高值，比层积前高出81.59%。图1G–I展示了种子在冷层积过程中呼吸途径关键酶活性的变化。呼吸途径中的关键酶PK的活性总体呈现下降趋势。在层积的初始阶段（0–30天），酶活性迅速且显著变化，层积30天时的酶活性比层积前下降了47.21%，之后变化相对稳定，层积90天时达到最低值，比层积前降低了48.36%。G-6-PDH的活性总体呈现缓慢上升的趋势，但在层积90天时酶活性迅速增加，比层积前高出39.32%。SDH的活性呈现缓慢下降趋势，在层积30–60天期间酶活性显著降低。层积120天时，酶活性达到最低值，比层积前降低了23.09%。这些结果与之前的研究一致。

图1 桃儿七冷层积过程中五个不同阶段的种子形态、生理生化特征变化。

2.种子层积过程中的代谢组分析

为了探究种子在层积过程中从休眠到萌发转变的潜在机制，使用LC-ESI-MS/MS进行了靶向植物激素检测。共检测到55种代谢物，鉴定出的植物激素在热图中展示（图2A），在不同的层积阶段（SM0-SM4）中，各种植物激素的表达水平发生了显著变化，包括在SM0中GA5表达显著增加，在SM3中2MeScZ表达显著增加，以及在SM4中BAP表达显著增加。相反，IAA-Trp和MEJA在SM0中的表达显著减少；IAA-Phe、Phe和GA7在SM1中的表达显著减少；2MeSiPR在SM3中的表达显著减少；以及tz和GA9在SM4中的表达显著减少。在后续的数据分析中，作者将特别关注这些显著改变的植物激素如何影响种子在层积过程中从休眠到萌发的转变（图2A）。与SM0相比，SM1中有7种代谢物显著下调，3种代谢物显著上调；SM2中有14种代谢物显著下调，11种显著上调；SM3中有19种代谢物显著下调，7种显著上调；SM4中有16种代谢物显著下调，7种显著上调（图2B）。PCA主成分分析显示样本被明确分为五个独立组，表明每个组内的代谢物存在显著差异（图2C）。在SM0-SM4期间，不同比较组共有及特有的差异代谢物情况如图2D所示。37种差异表达代谢物（DEMs）的相关性分析如图2E，包括ABA（1种）、生长素（10种）、细胞分裂素（13种）、GA（6种）、JA（4种）、SA（2种）和SL（1种）。

图2 不同层积阶段植物激素检测分析。

为了进一步评估种子在不同层积阶段差异表达代谢物（DEMs）的生物功能，对不同比较组的DEMs进行了KEGG富集分析。SM1_vs_SM0比较组的DEMs，在“泛醌和其他萜醌生物合成”通路显著富集（图3A）。研究表明，泛醌（UQ）和质醌（PQ）作为氧化磷酸化和光合作用中关键的电子载体，与能量产生和转化有着较大的相关性。种子在层积过程中经历了一系列复杂的生理和生化反应，导致内部代谢物的代谢水平发生显著变化。作者假设这一代谢通路的显著富集可能有助于能量产生和转移，为种子胚胎完成生理后熟提供必要的能量支持。“植物激素信号转导”通路不仅在SM2_vs_SM0比较组中显著富集，而且在SM4_vs_SM0比较组中也显著富集（图3B，3D），作者假设“植物激素信号转导”是通过调节种子内ABA和GA等关键休眠和萌发相关激素的浓度和动态信号，来协调层积过程中种子从休眠到萌发的转变。在SM3_vs_SM0比较组中，“类胡萝卜素生物合成”通路被高度富集（图3C）。

图3 不同层积阶段植物激素KEGG富集分析。

3.种子层积过程中的转录组分析

使用DIAMOND BLASTX软件将Unigene序列与多个数据库进行比对，包括KEGG、NR、Swiss-Prot、GO、KOG、Trembl和Pfam，共注释了99,587个Unigene（图4A）。使用小提琴图直观展示了每个层积阶段转录组数据的表达量密度分布（图4B）。此外，使用皮尔逊相关系数评估了不同样本间的相关性（图4C）。在NR数据库比对中，共有52,815个Unigene（53.3%）被注释。其中，36,384个Unigene被归类到19个已知具有同源序列的植物物种中，占NR数据库中总注释Unigene的68.9%（图4D）。通过与KOG数据库的比对和注释，成功匹配了33,542（33.68%）个Unigene，并将它们归类到25个详细类别中（图4E）。GO数据库注释表明，45,136（45.32%）个Unigene被归类到三个主要类别：生物学过程、细胞成分和分子功能，这些类别进一步细分为32个子类别（图4F）。KEGG数据库注释了40,112（40.28%）个Unigene。

图4 不同层积阶段转录组整体数据分析。

为了探索种子在不同层积阶段的分子机制，收集ST0（0天）、ST1（30天）、ST2（60天）、ST3（90天）和ST4（120天）的样本进行转录组测序，Q30和GC的比例分别为95.03~95.31%和45.04~45.99%。在四个不同的比较组中，共检测到65,372个显著差异表达基因（DEGs）。火山图展示在ST1_vs_ST0、ST2_vs_ST0、ST3_vs_ST0和ST4_vs_ST0比较组中分别鉴定到14,024个DEGs（8360个上调和5664个下调）、19,137个DEGs（11,251个上调和7886个下调）、16,501个DEGs（10,052个上调和6449个下调）以及15,710个DEGs（9075个上调和6635个下调）（图5A-D）。作者观察到与初始阶段（ST0）相比，其他三个层积阶段（ST1至ST4）差异基因的表达水平发生了显著变化，包括在多个层积阶段共表达的差异基因以及在特定层积阶段特异表达的差异基因，这种复杂的表达模式表明，这些差异基因可能在层积的不同阶段发挥特定的生物学功能。差异基因聚类热图揭示了不同层积阶段基因表达的显著变化（图5E–H），为深入研究种子在层积过程中从休眠到萌发的分子调控机制提供了宝贵的见解。

图5 不同层积阶段转录组数据差异分析。

为了进一步评估种子在不同层积阶段的差异表达基因（DEGs）的生物学功能，对DEGs进行了GO和KEGG富集分析。结果显示，在ST1_vs_ST0和ST2_vs_ST0中，DEGs显著富集的GO条目包括“驱动蛋白复合体”，“查耳酮合酶活性”，以及"柚皮素-查耳酮合酶活性"（图6A-B）。其中，最显著富集的是“驱动蛋白复合体”代谢途径。驱动蛋白复合体作为细胞中的关键分子马达蛋白，显著参与细胞内物质的运输过程，因此作者推测该代谢途径通过调节与休眠和萌发密切相关的蛋白质、酶和激素的运输，对种子的休眠和萌发过程产生显著影响。在ST3_vs_ST0中，DEGs显著富集的GO条目包括“细胞外空间通路”、“背腹轴极性决定通路”和“调控顶端分生组织发育”，其中“细胞外空间通路”是最显著富集的代谢途径（图6C），它与种子与外部环境的相互作用直接相关，涉及水分、养分和信号分子的吸收，为种子萌发提供关键物质。作者推测在种子萌发过程中，细胞外空间通路对于吸收外部水分和养分至关重要。此外，这个代谢途径可能也参与调节种子休眠，其中环境信号（如温度和光照）可能通过影响体外空间中的代谢物来触发休眠的释放，最终促进种子萌发。在ST4_vs_ST0中，DEGs显著富集的GO条目包括“响应含嘌呤化合物”、“box C/D RNP复合体”、“背腹轴极性决定通路”和“rRNA甲基转移酶活性”。其中，“响应含嘌呤化合物”是最显著富集的代谢途径（图6D）。，与种子的萌发和休眠状态密切相关。作为DNA和RNA的组成部分，以及细胞内信号传导的重要参与者，嘌呤的正常代谢对于细胞分裂和基因表达至关重要。

对ST1_vs_ST0比较组中的差异表达基因（DEGs）进行KEGG通路富集，“植物昼夜节律”通路显著富集，而“胞外多糖生物合成”通路高度富集（图6E）。昼夜节律对植物的多种生理过程有显著影响，包括光合作用、气孔的开闭和营养吸收。在层积过程中，的种子被覆盖在湿润的沙子中，并储存在4°C的恒温水箱中，导致它们长时间与氧气和光隔离。基于这些条件，作者推测“植物昼夜节律”通路的显著富集可能代表种子通过调节其昼夜节律来适应层积环境。胞外多糖（EPSs）是由许多生物体，包括植物分泌的复杂多糖，它们在细胞间粘附、细胞壁结构和细胞与环境相互作用中发挥关键作用。在层积过程中，种子内发生了一系列的生理和代谢活动。作者假设EPS通路的高度富集可能是种子适应层积环境（低温、低氧和低光）的生理响应。一方面，EPSs的增加可能有助于增强种子的抗逆性，保护它们免受不利环境条件的影响。另一方面，EPSs的增加可能促进种子内细胞间的信息传递和相互识别，为完成生理成熟和萌发创造有利条件。ST3_vs_ST0比较组中的DEGs显著富集在“异黄酮生物合成”通路，“胞外多糖生物合成”通路高度富集（图6F）。研究表明，异黄酮的生物合成受保守的miRNAs调控。鉴于miRNAs在生物体生长和增殖、细胞周期、凋亡和衰老等生物过程中发挥关键作用，作者推测激活或增强异黄酮生物合成可能与这些保守的miRNAs及相关转录因子的调控密切相关。ST4_vs_ST0比较组中的DEGs显著富集的通路是“病毒生命周期-HIV-1”，“植物激素信号转导”通路被高度富集（图6H）。在整个漫长的层积过程中，种子内发生了复杂的生理变化。这一通路的显著富集表明植物激素在精确调控种子萌发中发挥着关键作用。激素信号转导机制确保了激素信号的准确高效传递，促使种子内基因表达的重新编程。这反过来又调节了种子休眠的释放和萌发过程的启动，为植物激素介导的种子发育复杂机制提供了重要的见解。

图6 差异基因GO和KEGG富集分析。

4.代谢组和转录组联合分析

DEMs和DEGs的KEGG富集分析显示，S1_vs_S0比较组有10个显著富集的通路，S3_vs_S0有8个，其中“代谢途径”在两个比较组都高度富集（图7A，C）。作者假设这一代谢途径的显著富集，表明经过30天和90天的层积处理后，种子内发生了剧烈的代谢活动。从未经处理到层积条件的转变涉及环境因素的变化，如温度、湿度、光照和氧气水平，这些因素促使种子内的能量代谢途径进行调整。这些变化涉及营养物质的相互转换（如淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白质）以及与呼吸作用、糖酵解和三羧酸循环中的关键酶相关的代谢途径的激活或抑制。这些改变对于打破种子休眠和促进萌发至关重要。S2_vs_S0和S4_vs_S0比较组中分别包含13个和9个显著富集的通路，其中“植物激素信号转导”在两个比较组都是显著富集的（图7B，D）。作者推测，在0-60天和0-90天期间这一途径的显著富集，意味着在种子内精确调控激素信号转导和反应，以及多种关键植物激素（如赤霉素、脱落酸、生长素、茉莉酸等）相互作用网络的调节与平衡，对于打破休眠状态、加速生理成熟过程，最终促进种子成功萌发具有关键作用。

图7 DEMs和DEGs的KEGG共富集分析。

为了全面揭示种子在层积处理过程中从休眠到萌发的动态转变，作者进行了WGCNA分析。对所有样本进行聚类表明数据集具有良好的一致性和聚类特性（图8A）。WGCNA将所有差异表达基因分为18个模块（图8B）。在层积初始阶段（ST0），观察到ABA、IP、GA1、H2JA、JA的高表达与黄色和粉色模块显著正相关（图8C）。ABA的功能是抑制种子萌发，而GA1和CK通过促进细胞增殖和解除种子休眠，有助于维持休眠-萌发的动态平衡。在层积阶段（ST1），观察到2MeSiP、SA、iP7G、GA6的高表达与棕色和绿色模块显著正相关（图8C）。CK通过与GAs的协同作用，减轻ABA的抑制效应，从而促进种子萌发。同时，赤霉素家族成员GA6在打破种子休眠和促进萌发中发挥关键作用，通过上调与细胞壁降解、代谢过程和转录调控相关的基因表达，为种子萌发提供必要的生理和生化前提。在层积阶段（ST2），观察到tZRMP、GA19、GA3的高表达与青绿色模块的显著正相关（图8C）。这些植物激素通过复杂的相互作用和调控机制在种子休眠到萌发的转变中发挥重要作用。在层积阶段（ST3），观察到iP7G、GA53的高表达与红色和棕色模块显著正相关。在层积阶段（ST4），观察到GA53的高表达与蓝色、粉色和红色模块显著正相关。

图8 转录组和植物激素WGCNA分析。

种子的休眠与萌发是一个由多种植物激素精确调控的高度复杂的过程。作者的研究发现，种子在层积过程中从休眠到萌发经历了显著的表型转变。这种转变受到多种植物激素动态波动和调控的显著影响，包括脱落酸ABA、GA、IPR、5DS和JA。为了进一步深入探究层积过程中从休眠到萌发的机制，作者分析了差异表达基因和差异积累代谢物的KEGG通路，并通过相关性网络图直观展示了它们之间的显著相关性，从而揭示了这个动态转变背后的关键分子相互作用。ST1_vs_ST0比较组中的DEGs和DEMs富集到“代谢途径”、“次级代谢物生物合成”和“植物激素信号转导”，这三个途径都与ABA生物合成密切相关（图9A）。ST2_vs_ST0比较组中的DEGs和DEMs富集到的通路与ST1_vs_ST0比较组相同，这三个通路与与ABA、JA和GA53生物合成密切相关（图9B）。ST3_vs_ST0比较组中的DEGs和DEMs富集到的通路与ST2_vs_ST0相同，与ABA、JA、GA53、GA3、5DS和IPR的生物合成密切相关（图9C）。ST4_vs_ST0比较组中的DEGs和DEMs富集到的途径为“ko01100”和“ko01110”，与ABA、JA、GA53、GA3、5DS和IPR的生物合成密切相关（图9D）。

图9 DEGs和DEMs的相关性网络图。

本研究广泛探讨了种子在层积过程中胚胎的生理成熟以及内部营养和代谢物含量的动态变化。通过转录组和靶向植物激素分析，揭示了从休眠到萌发转变的复杂分子机制。结果表明，代谢物和基因的表达模式在各个层积阶段发生了显著变化，这些变化对调节种子休眠、刺激细胞增殖、增强环境适应性以及最终促进种子萌发起到了正面或负面的调控作用。此外，这些差异基因的表达模式与植物激素的合成和转化过程紧密相关，进一步强调了激素在种子萌发过程中的重要作用。并且鉴定出了枢纽基因，为后续进行功能验证和精细化研究提供了宝贵的见解。