【流式学习】10分钟梳理流式染色中固定的常见问题

作者：科研根号三发布时间：2024-10-10

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固定在组织学、形态学中十分常用，可保持细胞在某个时期的特点不被破坏，便于观察。

一、为什么要固定细胞？

固定细胞有以下好处：

1. 获得充足的时间。固定后，你可以从容地在适当的时间或流式细胞仪可用的时候再上机，无需火急火燎的。这在你做一个很耗时间的实验或者流式细胞仪需要付费预约时非常有用。

2. 更安全。固定后，细胞不再有活性，所以生物安全性更好。在一些处理生物危险样品的实验室中，是强制要求固定的。

3. 更方便、易用。

4. 便于检测胞内抗原。为了检测胞内抗原，需要先固定细胞，使得细胞表面标记固定并且有利于后续的破膜。

二、固定剂的种类

如果你需要固定细胞，那么你选择什么固定剂呢？简单归类，目前最常用的其实是两大类--醇类和醛类。

1.醇类

醇类，通常用到的是乙醇和甲醇，它们可使蛋白凝固，属于沉淀或变性固定剂。它们还可以溶解脂类，所以会在细胞质膜、核膜上打出很大的孔。醇类在你需要检测DNA时非常有用，它们使得蛋白质和DNA凝固，染料更容易结合，获得更好的CV值（变异系数）。

不过，正如你所担心的那样，因为醇类会破坏蛋白质的构象，所以如果你的抗体与目标蛋白的结合依赖于其特定构象或表位，那么就成大问题了。因此，在很多时候醇类固定会使得你的实验结果出现［检测的目标蛋白/抗原明明在细胞内却偏偏测不到］的怪异现象。唯一的例外是一些小的表位，例如磷酸化特异性抗体。

2.醛类

醛类是交联类固定剂，可在赖氨酸残基之间建立连接键，从而能够保持大多数蛋白的完整性，使得目标蛋白/抗原的构象保持完整。

①甲醛

流式细胞术中常用的醛类固定剂就是甲醛，甲醛本身是气体，溶解于水后形成37~40％的溶液，再加入10~15％的甲醇防止多聚化，否则甲醛会多聚化形成多聚甲醛（PFA）。

有个常见的错误就是大家都认为是用多聚甲醛固定细胞，实际上，多聚甲醛是一种不能溶解的白色粉末，没法用来固定任何东西，我们平时所谓的配制多聚甲醛溶液，实际上就是通过加热方法获得的不含甲醇的甲醛溶液（配制方法见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1886-1-1.html）。

为了固定，需要用PBS将甲醛溶液稀释到0.5％~4％。

②戊二醛

戊二醛广泛应用于电子显微镜中，在流式细胞术中用的很少。这是因为它的交联作用比甲醛还要强，所以导致抗体和染料可能更难结合到相应的位点，此外它还会显著增加细胞自发荧光，所以不到非不得已，尽量还是用甲醛或醇类。

三、细胞固定后可以保存多久？

细胞用乙醇固定后在4~20℃可以保存数月。

甲醛固定的细胞则只能保存1~2周，而且乙醇保存时可以将细胞悬浮在乙醇中，甲醛固定2~3小时后必需离心去除，否则固定时间过长会导致自发荧光显著增高。离心之后，细胞就可以保存在PBS中了。

自发荧光增高其实任何固定剂都会有，所以如果你要检测表达非常弱的抗原，就得小心了，而且固定后细胞的光散射参数会发生改变，这也是你需要注意的地方。

下面这张图是从某杂志上找来的图片，可以看出固定后FSC、SSC改变，自发荧光增强明显。

四、联合应用固定剂：两全其美

可以联合使用固定剂，通常的做法是首先用甲醛固定，然后用醇类固定。甲醛固定后可使细胞内任何东西保持原样，之后的醇类固定会使细胞各种膜上出现大孔，有利于抗体和探针进入。第二步的固定剂除了醇类，还可以用破膜类试剂，例如Triton X-100或Tween-20。

五、流式实验中，哪些情况下需要对细胞进行固定处理？

1.检测细胞内指标

我们在流式胞内实验时，比如检测细胞因子（如IFN-γ）或者核内转录因子（如Foxp3）的时候，在样本染完表面指标后，一般需要先进行固定（或者固定破膜一起），然后再进行破膜（打孔）以及后续的胞内指标染色操作。

2.延长样本的保存，获得充足的上机时间

最常见的情况是染色处理完已经到很晚，平台老师已经下班或者自己的身体已经扛不住通宵做实验了，这个时候需要对样本进行固定处理，放到第二天检测，这里的固是定为了保持检测指标的稳定性；另一方面，当样本特别多的时候，第一管样本和最后一管样本的时间间隔会很久，这种情况下考虑上机前做一下固定，保持前后数据的一致性，比如CD11b这个指标在白细胞中的表达会随着样本放置时间的增加而上调。

3.生物安全性考虑

做流式的同学们都知道，流式检测的样本多种多样，有可能我们接触的样本是疾病相关的，有的时候甚至是传染病相关的。比如临床检测的样本有可能来自于HIV病人，在这种特殊的情况下，我们希望能够对样本做固定处理或者是预固定处理，这样会大大增加操作人员的安全性。

4.对蛋白翻译后修饰的检测

在蛋白翻译后修饰（磷酸化、乙酰化、甲基化等）的研究过程中，固定剂不仅可以有效的“固定”住翻译后修饰的位点（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等），也可以防止目标位点在活细胞中很快降解（比如磷酸酶会去除磷酸化修饰、去甲基化酶会移除甲基化修饰等）。下面的例子是用IL-6的重组蛋白刺激人外周血15分钟后看STAT3第705位酪氨酸的磷酸化水平，在刺激完样本后就需要通过固定来实现目的氨基酸磷酸化水平“停留”在IL-6刺激15分钟这个节点上。

左图：未用IL-6刺激，细胞固定后染色；右图：用IL-6刺激15分钟，细胞固定后染色。

六、流式实验中固定会遇到的问题及应对建议？

理想的固定剂能使抗原固定，同时保持细胞、亚细胞结构的真实性，同时能够保证抗体与所有细胞及亚细胞结构内抗原的充分接触。但“理想很丰满，现实很骨干”，固定的过程或多或少对流式检测带来一些影响，只有了解了固定对流式染色带来的影响我们才能更好的做好流式实验。

1.固定对荧光染料的影响是什么？

主要表现在固定剂对串联染料（tandem-dye，如APC/Cy7、PE/Cy7等）的影响：一个是固定剂有可能造成串联染料的断裂，比如APC-Cy7和4%多聚甲醛溶液接触时间超过4个小时染料就有可能断裂，所以如果细胞直接重悬在固定液里面建议尽快上机，如果要放到第二天上机，需离心去除固定液后重悬在流式染色液或者是PBS里面，当然有一些新的串联荧光素可以有效减少这种情况，比如BioLegend的APC/Fire750TM染料。

另外一个是固定剂有可能造成串联染料的荧光“溢漏（spillover）”增加，对于这类情况的建议是配色允许的情况下减少串联染料的使用（但实际上很多多色panel来说，这都不算是一个解决方案）；另外，使用一些商业化的固定buffer，也有可以在一定程度上减少荧光“溢漏”，如下图所示：

2. 4%多聚甲醛溶液固定后的样本可以保存多久？

一般建议不要超过24个小时，固定后的样本放置时间越久，背景信号会越高，即使固定后的细胞重悬在不含固定剂成分的缓冲液中也会造成背景升高（我们建议固定后的样本离心除去固定剂，重悬在流式染色缓冲液或者PBS里面）。

如果需要长时间保存样本，建议在样本做完表面染色和固定后，保存在专门的保存缓冲液中。但即便是有专门的保存buffer，对于用了串联染料（如APC/Cy7、PE/Cy7等）染色的样本，我们还是建议不要长时间保存，很难避免补偿的“漂移（shift）”。

3. Ki-67染色时，选择哪种固定方式？

流式在检测一些特殊的核内指标时，一般都会有推荐的固定破膜方案。比如在Ki-67染色一般会推荐用70%的冰乙醇作为固定剂（含打孔作用），如前文提到的脱水剂类固定剂对蛋白空构象的影响大，在单染Ki-67的时候，乙醇的固定方式是完全没有问题的，但是在和其它指标共染时，就需要考虑乙醇固定的方式和其它抗体兼容性的问题，比如CD38 (Clone: HIT2)的抗体是明确不能和乙醇固定的方式兼容，而CD34 (Clone: 581)很大程度上可以兼容这种固定方式。醇类和其它抗体（Clone）的兼容性很难一一验证，所以在做Ki-67染色的时候我们也会用FOXP3的固定/破膜方式来替代乙醇的方案，而且大多数时候是可以获得不错的染色结果。

4. 对于需要先固定再染色的样本，注意点在哪里？

流式实验中，有一些情况我们希望或需要对样本进行预先固定处理，比如前文说过的传染病人的样本或者是需要检测蛋白翻译后修饰的样本。对于需要预固定的样本，首先需要考虑预先固定处理对检测指标的影响，有很多指标先染色再固定和先固定再染色出来结果差异非常大，导致这些差异原因和指标的类型、抗体的克隆号等因素都有关系。如果我们的流式实验要求对样本进行预先固定的处理，那实际上这就需要提前去验证染色方案里所选的克隆是否适用于先固定后染色，这也有一定工作量。

5. 样本需要先固定再染色，但方案里的一些指标不兼容预先固定，该怎么办？

这个问题其实相当棘手，因为据我们了解的情况，目前市面上还没有一个试剂生产厂家有这样“完美”固定试剂可以先固定样本而不对后续染色产生任何影响，如果有的话，那我们今天所说的关于固定的问题，都不算是问题。

在实际遇到预固定和指标不兼容时，我们会做如下建议：（1）使用替代指标来更换那些受固定影响的指标；（2）如果没有可以替代指标，请根据实验重要性原则来取舍检测指标，比如是磷酸化的指标会比表面的指标更为重要。虽然这一段看起来有一点像“废话”，但我们需要在实际实验过程中学会做取舍和判断。

七．实现完美固定的几点小技巧

1. 染色顺序

染色和固定的顺序需要根据你要解决的问题而定。如果要同时检测表面和胞内位点，那么最好先染表面抗原，然后固定。需要注意的是，有些荧光素对固定很敏感，例如PE和APC，它们都是大分子蛋白，所以也跟其它蛋白一样，容易受固定影响，所以要避免用醇类，而小分子荧光素（如Alexa Fluor 488和FITC）不会受固定影响。

2. 使用冷溶液

这里有一些实用技巧需要牢记：

2.1 固定需要使用冷溶液，因为固定是个放热过程。

2.2 在加入固定剂时，一边加，一边轻柔涡旋振荡细胞，以减少细胞成团。一个细胞团块至少加1ml固定液。

TIPS: 如何固定？固定破膜操作后是否需要再次固定？

当天能上机，染色缓冲液或者PBS。
当天不能上机，4% PFA 固定半小时后，洗掉PFA在染色缓冲液中4度保存，或者直接1% PFA 4度固定保存（不需要洗）。
FACS Buffer：PBS+2% FBS（降低部分非特异性染色，保持细胞状态）+1mM EDTA（防止细胞黏连）
正常来说，已经固定破膜操作后染胞内抗体可以再次固定，因为还要固定住胞内分子及其荧光素，具体看老师的实验需求，有的人会固定过夜，第二天在破膜继续操作！有的人会在破膜液里染色过夜，第二天上机！看老师预实验结果选择合适的方法。