南农陈发棣多组学揭示菊花毛状体形成和萜类合成调控网络抗虫机制

毛状体是覆盖大多数陆生植物地上样本的特殊突起。不同种类的毛状体在物种中存在很大的差异，但是大多数植物物种中毛状体形成的分子调控机制和生物学功能仍未被探索。近日，南京农业大学陈发棣校长团队在New Phytologist上发表题为“CmMYC2–CmMYBML1 module orchestrates the resistance to herbivory by synchronously regulating the trichome development and constitutive terpene biosynthesis in Chrysanthemum”的研究论文。研究者通过转录组与代谢组检测技术对去毛叶片和完整叶片进行分析，探索了毛状体形成和萜类化合物合成的调控网络，并揭示了毛状体在抗虫防御中的物理和化学作用。

1.毛状体相关转录因子CmMYC2的鉴定和表征

去除毛状体(t型和腺型)叶片，完整毛状体的“金霸”叶片进行转录组测序，基于差异表达水平筛选出14个毛状体相关基因。其中，DEG最高的Unigene16969_All在完整叶片中的表达量是去毛叶片的近19倍(图1a)。氨基酸序列比对表明，Unigene16969_All属于典型的MYC家族。系统发育分析显示，Unigene16969_All与黄花蒿 AaMYC2亲缘关系密切，并被重命名为CmMYC2(图1b)。CmMYC2在茎、叶、叶芽、花蕾等多个器官中广泛表达，其中在叶的顶芽和毛状体中表达量较高(图1c)。亚细胞定位分析显示CmMYC2定位于细胞核(图1d)。原位杂交结果显示，CmMYC2的mRNA主要聚集在顶芽鳞片的毛状体中，而不是在叶原基中间(图1e)。GUS染色结果显示，CmMYC2启动子的活性集中在南芥的叶尖、根部，尤其是毛状体中。此外，通过酵母自激活实验和LUC实验进一步证明CmMYC2是一种转录激活剂。

图1 菊花CmMYC2的鉴定及表达模式研究

2. CmMYC2阻止斜纹夜蛾的取食

与野生型菊花植株相比，CmMYC2过表达和抑制植株在形态上有明显差异（图2a），转基因株系中CmMYC2的转录水平显著高于野生型植株（图2b）。三个CmMYC2过表达转基因株系中，T形和腺毛状体的密度分别比野生型植株增加了2.3至2.5倍和1.8至2.2倍。相比之下，三个抑制株系的叶片腹面（上表面）的T形和腺毛状体密度分别比野生型株系降低了30-70%和44-66%（图2a, c, d）。通过GC-MS鉴定，CmMYC2过表达植株中挥发性萜类（包括单萜和倍半萜）的总含量显著增加，提高了1.4至1.5倍，CmMYC2抑制植株中挥发性萜类的总含量减少了9-13%（图2e-g）。对CmMYC2转基因植株的生物测定显示，斜纹夜蛾幼虫在CmMYC2-OE-3植株上的取食面积比野生型植株减少了2.8%，而在CmMYC2-SRDX-12植株上增加了7.0%（图2h,i）。此外，取食野生型植株的斜纹夜蛾的质量增长率为1.3%，而在CmMYC2-OE-3和CmMYC2-SRDX-12植株上取食的斜纹夜蛾的质量增长率分别为0.8%和2.0%（图2j）。

图2 野生型(WT)和CmMYC2转基因菊花植株的表型特征

3. CmMYBML1基因的筛选与鉴定

对CmMYC2过表达（OE）和野生型（WT）进行转录组分析，共鉴定出1912个差异表达基因（DEGs），其中包括1050个上调和862个下调基因（图3a）。差异基因GO富集分析与“萜烯合酶活性”和“萜类生物合成/代谢过程”显著富集（图3b），这验证了CmMYC2在调节萜类生物合成和代谢物方面的作用。与腺毛发育相关的转录因子中，TRINITY_DN9011_c0_g1在CmMYC2过表达株系中的转录水平显著增加，功能注释为R2R3 MYB家族的MIXTA（图3c），被重新命名为CmMYBML1。CmMYBML1的表达水平在CmMYC2过表达和抑制株系中表现出显著差异。系统发育分析显示，CmMYBML1序列与AaMIXTA1的序列密切相关（图3d）。空间表达模式显示，CmMYBML1在毛状体中表达最高，其次是顶芽和花芽（图3e）。GUS染色结果显示，在proCmMYBML1-GUS转基因拟南芥植株中，毛状体基部和叶脉中显示出强烈的染色（图3f）。

图3 利用RNA-Seq分析从野生型(WT)和CmMYC2过表达菊花中鉴定CmMYBML1

4. CmMYBML1通过调节毛状体密度和组成萜烯含量来阻止斜纹夜蛾取食

SEM分析显示，CmMYBML1-OE-8和CmMYBML1-SRDX-1系两种毛状体的密度与荧光显微镜观察结果一致(图4a)。与WT植株相比，转基因植株中CmMYBML1基因的表达水平升高(图4b)。在两个过表达的转基因品系中，t形毛和腺状毛的密度分别比对照植株增加了1.3倍和1.5倍。相比之下，CmMYBML1-SRDX系t形毛和腺状毛的密度分别下降了20-25%和32-38%(图4a,c, d)。CmMYBML1-OE总萜含量提高了1.2倍(单萜提高了1.2倍，倍半萜提高了1.24倍)。相反，CmMYBML1-SRDX系中萜烯总含量降低了12.4-14.6%(图4e-g)。这些结果表明，CmMYBML1也积极影响挥发性萜的产生。其次，生物测定显示，与WT相比，CmMYBML1-OE-8菊花植株的取食面积减少了1.3%，而CmMYBML1-SRDX-1植株的取食面积增加了3.8%(图4h,i)。幼虫消耗的叶片总面积与幼虫的增重成正比。如图4(j)所示，幼虫侵染后72 h，斜纹小蠊幼虫在WT植株上的增重率为0.5%，而在CmMYC2-OE-3和CmMYC2-SRDX-12植株上的增重率分别为0.2%和1.1%。

图4 野生型(WT)和CmMYBML1转基因菊花的表型

5. CmMYBML1在体外和体内与CmMYC2相互作用

为了进一步鉴定CmMYC2的互作物，作者建立了菊花毛状体酵母双杂交筛选文库。筛选文库结果显示CmMYC2与CmMYBML1发生物理相互作用(图5a,b,d)。在烟草共表达的pSPYNE - CmMYC2和pSPYCE-CmMYBML1中，通过生物分子荧光互补(BiFC)实验证实了CmMYC2和CmMYBML1之间的相互作用(图5c)。体外下拉实验，CmMYBML1在E. coil BL21中表达并纯化。洗脱后，在GST-CmMYC2中检测到his标记的CmMYBML1特异性结合，而在对照组中观察到非his标记的CmMYBML1条带。这些结果表明CmMYC2在体外与CmMYBML1相互作用(图5e)。通过酵母单杂实验，双荧光素酶实验，ChIP-qPCR实验，EMSA实验，验证CmMYC2通过结合其启动子直接激活CmMYBML1的转录（图6）。

图5 在菊花中，CmMYBML1在体内和体外均与CmMYC2相互作用

图6 CmMYC2直接激活菊花CmMYBML1基因

6. CmMYBML1参与CmMYC2介导的毛状体发育和萜烯合成

与CmMYC2-OE-3/CaLCuV载体感染植株相比，CmMYC2-OE-3/CaLCuVamiRMYBML1载体感染植株中CmMYBML1的表达量下降了48%，t形毛和腺状毛的密度分别下降了48.3%和57.9%(图7a-c)。CmTPS9和CmTPS12的表达水平均较对照显著下调，萜烯总含量较对照降低34.5%(图7d-f)。此外，斜纹夜蛾幼虫在CmMYC2-OE-3/CaLCuV植物叶片中的摄食面积(0.9%)低于CmMYC2-OE-3/CaLCuVamiRMYBML1植物叶片中的摄食面积(10.6%)(图7g,h)。随着叶片消耗面积的增加，斜纹夜蛾幼虫的增重也随之增加。取食CmMYC2-OE-3/CaLCuVamiRMYBML1植株的幼虫增重率提高了2.5%，而取食CmMYC2-OE-3/CaLCuV植株的幼虫增重率仅为0.6%(图7i)。

图7 CaLCuv- amiRMYBML1和CaLCuv载体侵染CmMYC2过表达菊花植株的表型

7.CmMYBML1结合CmTPS9/CmTPS12基因的启动子直接激活其转录

通过转录组分析，鉴定出两个在CmMYC2过表达株系中表达显著上调的CmTPS基因。CmTPS9是之前研究过的，而另一个新发现的CmTPS基因被命名为CmTPS12。同时，上述结果也暗示了CmMYC2通过CmMYBML1调控萜烯合成。因此，作者进一步探索了CmMYC2或CmMYBML1是否参与了萜烯合成的调控。酵母单杂交实验表明，CmMYC2和CmMYBML1蛋白的共存可以削弱CmMYBML1对CmTPS9/CmTPS12启动子激活功能。ChIP-qPCR分析显示，在CmMYBML1过表达植株中，含有MYB基序(CAACTG)的CmTPS9启动子“P1”区域明显富集（图8e）。EMSA结果表明，GST-CmMYBML1可以与包含MYB基序（CAACTG）的DNA生物素探针结合（图8f）。基于ChIP-qPCR和EMSA的结果，也证明CmMYBML1蛋白能够结合到CmTPS12启动子中的MYB基序。

图8 CmMYBML1直接激活菊花CmTPS9基因

本研究以菊花为模式植物，探讨了毛状体形成和萜类化合物合成的调控网络，揭示了毛状体在抵御食草动物摄食中的组成防御中的物理和化学作用。通过分析去毛叶片和完整叶片的转录组分析，发现CmMYC2对t形毛和腺状毛的发育以及腺状毛中萜类化合物的含量都有正向调节作用。发现CmMYC2在毛状体形成和萜烯合成中的作用是通过与CmMYBML1的相互作用介导的。研究结果揭示了一个复杂的分子机制，其中CmMYC2-CmMYBML1反馈抑制回路调节毛状体(非腺状和腺状)的形成和萜烯的生物合成，共同促进对斜纹夜蛾幼虫的抗性增强。本发现为植物同步调节毛状体密度以抵御草食的物理和化学防御的新型调控网络提供了新的见解。