重磅！类器官体系促进小鼠成肌细胞去分化至全能肌肉干细胞
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社
肌肉再生能力的下降与多种肌肉疾病（如肌营养不良症）相关，这些疾病影响了肌肉的功能和质量。传统的肌肉干细胞（卫星细胞）在损伤后能够自我更新并促进肌肉再生，但在某些情况下，这种能力可能受到限制。
来自美国哈佛大学干细胞研究所的一项最新研究利用类器官培养系统，成功地将小鼠肌肉前体细胞转化为体外培养的卫星细胞（idSCs），这些idSCs展现出强大的自我更新能力和肌肉再生潜力。在小鼠模型中，idSCs能够有效地融合成肌纤维，重新填补卫星细胞的生态位，并在多次肌肉损伤后支持肌肉再生，功能上与新鲜分离的卫星细胞相当，甚至表现出更优的再生能力。这一发现为未来的肌肉疾病治疗提供了新的细胞来源和治疗策略。
文章介绍
题目：Organoid culture promotes dedifferentiation of mouse myoblasts into stem cells capable of complete muscle regeneration
杂志：Nature Biotechnology
影响因子：IF=33.1
发表时间：2024年9月11日
#1
研究背景
Background
卫星细胞作为肌肉干细胞，在肌肉的生长、再生及维持中扮演着核心角色。它们平时处于静息状态，隐匿于基底膜与肌肉肌膜之间，一旦肌肉受损，这些细胞便会被激活，通过不对称分裂实现自我更新或转化为肌母细胞，后者进一步分化融合成肌管，构建骨骼肌的基本功能单位。若缺乏卫星细胞，骨骼肌的再生将无从谈起。肌肉修复后，部分卫星细胞会再次回归静息状态，为未来的再生潜能蓄势待发。尽管卫星细胞治疗肌肉疾病的潜力巨大，但其在体内数量稀缺，且难以在体外有效扩增同时保持其干细胞特性。传统的培养方法往往促使卫星细胞转变为肌母细胞，削弱了其再生能力。
然而，三维培养技术的出现为这一难题带来了转机，它不仅能够模拟体内干细胞生态位，促进卫星细胞或类似细胞的扩增，还能保留其分化与再生的能力。研究显示，在三维培养条件下，肌母细胞能够转化为体外衍生卫星细胞（idSCs），这些细胞在移植后能像卫星细胞一样促进肌肉再生，尽管它们在转录组和表观基因组层面与天然卫星细胞存在差异，但这一发现为肌肉疾病的细胞治疗开辟了新途径，同时也引发了关于体外培养细胞与体内细胞身份关系的深入探讨。
#2
研究方法
Methods
识别问题：传统的细胞疗法在治疗骨骼肌疾病时效果不佳，主要是因为使用了承诺的肌源前体细胞，而非真正的肌肉干细胞（卫星细胞）。因此，研究的首要目标是寻找一种方法来生成具有卫星细胞特征的细胞。
开发新方法：研究者提出了一种从骨骼肌组织中生成体外衍生卫星细胞（idSCs）的方法。这一方法的开发是基于对卫星细胞生物学的深入理解，旨在通过体外培养和诱导来获得功能性卫星细胞。
功能验证：通过将idSCs移植到小鼠肌肉中，研究者验证了这些细胞的功能，包括它们的融合能力、自我更新能力以及在肌肉再生中的作用。这一验证是评估idSCs是否可以替代传统卫星细胞的关键步骤。
比较分析：研究者对idSCs、肌母细胞和卫星细胞的表观基因组和转录组特征进行比较，以识别出与卫星细胞功能相关的核心信号通路和基因。这一分析有助于理解idSCs的生物学特性及其与其他细胞类型的区别。
临床应用前景：研究者还探索了从人类肌肉活检中生成类似卫星细胞的细胞的可能性，表明该方法在临床治疗遗传性肌肉疾病、创伤引起的肌肉损伤和与年龄相关的肌肉虚弱方面的潜在应用。
科学与临床结合：研究思路强调了基础科学研究与临床应用之间的联系，旨在通过科学发现推动新疗法的发展。
#3
研究结果
Results
1、SkMO 包含卫星样细胞
表达转录因子Pax7的卫星细胞在肌肉维持和再生中起关键作用。在肌肉再生过程中，肌母细胞（表达Pax7和MyoD）激活MyoD以进行成肌分化和承诺，同时Pax7的下调导致干细胞潜能的丧失。为探究肌母细胞（Pax7+MyoD+）是否能逆转回卫星细胞样状态（Pax7+MyoD-），研究人员通过旋转瓶培养肌母细胞，使其自组装成骨骼肌类器官（SkMOs）。减少血清浓度后，SkMOs中主要为表达肌球蛋白重链（MyHC）的细胞和靠近肌管的Pax7+细胞，且晚期SkMOs中Pax7+细胞仅少数表达MyoD。利用Pax7nGFP转基因报告小鼠纯化卫星细胞并培养生成SkMOs，结果显示约18%的细胞为GFP+，且表现出与卫星细胞相似的特征。尽管亲代肌母细胞处于增殖状态，但晚期SkMOs中Pax7+细胞多处于静息状态，且体积较小，类似新鲜分离的卫星细胞。进一步实验表明，新鲜分离的卫星细胞和SkMO衍生的GFP+细胞均能在悬浮中形成集落，显示干细胞样特性，而肌母细胞则不能。SkMO衍生的GFP+细胞还能在标准培养条件下扩展SkMOs并分化为多核肌管，证实了其再生能力。研究认为，在类器官培养条件下，肌母细胞可以脱分化并获得卫星细胞特性，成为体外衍生卫星细胞（idSCs）（图1）。
图 1：小鼠成肌细胞可以形成与卫星细胞具有相同体外特征的 SkMO
2、卫星细胞和 idSC 具有转录相似性
该研究通过多重RNA测序（RNA-seq）技术，分析了体外衍生卫星细胞（idSCs）在类器官培养中从肌母细胞发育过程中的转录变化。研究人员使用Tg:Pax7nGFP小鼠的新鲜分离卫星细胞、肌母细胞和idSCs进行RNA-seq，鉴定了参与卫星细胞维持和激活的关键基因。分析结果显示，idSCs与内源性卫星细胞紧密聚类，与肌母细胞和Pax7+储备细胞区分开来。
关键发现包括识别了与Notch信号通路、早期激活/应激反应、静息状态、细胞表面标志物、细胞外基质（ECM）成分和分泌生长因子相关的基因，这些基因在idSCs和卫星细胞与肌母细胞之间表现出差异。进一步筛选差异表达基因后，确定了idSCs与肌母细胞之间有1,347个基因、卫星细胞与肌母细胞之间有1,272个基因、idSCs与卫星细胞之间有774个基因存在差异。
层次聚类分析显示，idSCs和卫星细胞在转录模式上共享减少转录、翻译和细胞周期进展的特点，同时表现出增加的静息状态和应激反应。然而，idSCs和肌母细胞在氧化磷酸化和碳代谢相关途径上与卫星细胞存在差异，表明idSCs在转录谱上既具有独特性又处于中间状态，与肌母细胞和卫星细胞均有所不同。功能富集分析强调了如焦点粘附和Notch信号等保守途径在idSCs和卫星细胞中相对于肌母细胞上调，这表明idSCs在保留卫星细胞某些特性的同时，也共享了肌母细胞的一些特征（图2）。
图 2：idSC 与卫星细胞具有关键的转录相似性
3、表观基因组变化调节/是 idSC 形成的基础
该研究探讨了从肌母细胞形成诱导卫星细胞（idSCs）过程中涉及的显著表观遗传变化，特别是染色质结构的变化，这对调控干细胞特性至关重要。通过使用Omni-ATAC-seq技术进行时间分析，研究人员观察了在类器官培养中idSC生成不同阶段（第10天、20天和30天）的染色质动态。分析揭示了约40,000个与肌源性反应相关的染色质区域，这些区域在不同细胞状态（肌母细胞、idSCs和卫星细胞）中表现出不同的染色质可及性模式。
研究确定了五类染色质区域，其中1.1和1.2类区域在肌母细胞中开放但在卫星细胞和idSCs中关闭，表明从肌母细胞状态向卫星细胞状态的转变。这些区域与肌肉发育和收缩相关的生物过程有关。2.1类区域在肌母细胞和中期至晚期idSCs中共有，与血管发育和细胞因子产生相关；而2.2类区域仅在中期和晚期idSCs中独特存在，与肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质（ECM）组织相关。3类区域主要在卫星细胞中开放，与碳水化合物代谢和细胞周期调控相关。
研究结果表明，随着idSCs的成熟，它们逐渐沉默肌母细胞的表观遗传状态，同时采用卫星细胞特有的染色质特征，特别是在ECM和肌动蛋白重塑方面。此外，研究还强调了转录因子（TFs）在这一转变过程中的动态结合，特别是随着idSCs的发育，MyoD在特定位点的占据显著减少，进一步支持了与肌源性程序相关的染色质关闭。
总体而言，该研究强调了从肌母细胞到idSCs转变过程中表观遗传变化的重要性，揭示了促进这一过程的调控机制，以及idSCs在肌肉再生中可能具有与天然卫星细胞相似的功能（图3）。
图 3：成肌细胞中定义生肌程序的关键调控区域在 idSC 生成过程中被沉默
4、idSC 可与卫星细胞一样再生肌肉
该研究比较了在肌肉损伤小鼠模型中，诱导卫星细胞（idSCs）与传统卫星细胞和肌母细胞的再生能力。主要发现包括：
移植与监测：使用Tg:Pax7nGFP报告基因小鼠的初级肌母细胞感染慢病毒，生成双报告细胞（nGFP+ tdTomato+），以便在NSG小鼠的胫骨前肌（TA）中诱导双侧心脏毒素（CTX）损伤后，通过生物发光成像（BLI）分离和追踪移植细胞。
植入与持久性：移植后，idSCs的辐射强度随时间显著增加，表明其持久性优于肌母细胞（肌母细胞的辐射强度下降）。21天后，idSCs的辐射强度为320万光子/厘米²/秒，而肌母细胞仅为0.007万光子/厘米²/秒。
肌纤维形成：idSCs在肌肉切片中贡献了5.8%的tdTomato+纤维，显著高于肌母细胞的0.02%。此外，idSCs能够重新填充卫星细胞的位置，其中14%的Pax7+细胞源自idSCs，而肌母细胞的贡献可忽略不计。
自我更新能力：idSCs在多次损伤后仍能自我更新，保持其植入和促进肌肉修复的能力，而肌母细胞则未能表现出类似的结果。
与卫星细胞的比较：在肌营养不良模型中，idSCs的植入率与新鲜分离的卫星细胞相当或更高，表明它们作为有效肌肉干细胞的潜力。
综上所述，研究发现idSCs不仅有效再生肌肉，而且具有与卫星细胞相似的特性，使其成为肌肉修复治疗的有希望候选者（图4、5）。
图 4：idSC 在体内植入、重新填充并自我更新
图 5：idSC 在缺乏肌营养不良蛋白的小鼠模型中体内植入、重新填充并自我更新
5、idSC 可以与卫星细胞同等程度地恢复肌肉功能
本研究比较了诱导卫星细胞（idSCs）、卫星细胞和肌母细胞在恢复肌肉功能方面的能力。实验中，NSG小鼠的胫骨前肌（TA）经过辐射和心脏毒素（CTX）损伤处理，随后分别移植了10,000个idSCs、肌母细胞或卫星细胞。结果表明，idSCs产生的特定力为138 ± 20.49 kN × m²，与卫星细胞产生的力（178 ± 16.43 kN × m²）相当，而肌母细胞产生的力几乎可忽略不计（3 ± 0.88 kN × m²）。组织学评估显示，idSCs和卫星细胞对肌纤维再生的贡献显著，idSCs每切片产生1,965 ± 313根纤维，而卫星细胞产生1,535 ± 145根纤维，肌母细胞仅产生84 ± 12根纤维。
此外，idSCs和卫星细胞在再生后均能有效重新填充卫星细胞的位置，表明它们在功能上的相似性。研究还探索了一种基于特定细胞表面标记物的idSCs纯化策略，实现了高纯度的分离群体。总体而言，研究发现idSCs在恢复肌肉功能方面与卫星细胞相当，展示了其在肌肉再生疗法中的潜力（图6）。
图 6：idSC 在移植到再生肌肉后生成功能性肌肉的能力与卫星细胞相似
6、人skmo中idSC形成的再现
在这项研究中，研究人员从患者活检中获取人类肌母细胞系或从商业来源购买，并在增强的无血清培养基中生成了人类卫星肌肉干细胞样细胞（SkMOs），采用了缩短的15天培养方案。结果显示，在肌母细胞阶段与SkMO培养15天后，人类肌肉细胞表面标记物的表达存在细微差异。尽管在不同实验中存在变异，PAX7+细胞在肌母细胞系中相对稀少（3.5% ± 3%）。形成SkMOs后，PAX7+细胞的比例在不同实验间的变异性降低，约占总细胞的5% ± 1%。值得注意的是，肌母细胞中的PAX7+细胞主要为MYOD+（84% ± 2%），而在SkMOs中，MYOD+细胞仅占少数（5% ± 2%）。此外，从增殖的肌母细胞转变为人类SkMOs时，EdU+细胞的比例整体下降，导致PAX7+ EdU+细胞的比例从肌母细胞的30% ± 22%降至SkMOs的0.8% ± 1.7%。这些发现表明，SkMO的形成促使肌母细胞去分化为一种保持Pax7表达而缺乏MyoD表达的静息状态（图S9）。
图 S9. 无血清人类 SkMO 生成含有 PAX7 表达细胞
总结
本研究充分体现了类器官技术在生成诱导卫星细胞（idSCs）方面的重要性，这种技术能够在三维培养条件下有效模拟卫星细胞的微环境，从而促进细胞的扩增和功能保持。idSCs展现出与天然卫星细胞相似的再生能力，能够在体内植入并支持肌肉修复，解决了传统肌肉干细胞来源稀缺的问题。通过从人类肌肉活检中生成idSCs，类器官技术为治疗遗传性肌肉疾病和创伤引起的肌肉损伤提供了新的潜在解决方案。
参考信息：
Price FD, Matyas MN, Gehrke AR, et al. Organoid culture promotes dedifferentiation of mouse myoblasts into stem cells capable of complete muscle regeneration. Nat Biotechnol. Published online September 11, 2024. doi:10.1038/s41587-024-02344-7
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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社