线粒体 | 结构、功能、分裂方式、分离方法、检测方法

作者：南京福麦斯生物发布时间：2024-09-26

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线粒体是产生维持细胞活动所需能量的细胞器（通常，每个细胞大约有 2000 个线粒体，约占细胞体积的 25%），从细胞质中吸收底物，并利用它们驱动脂肪酸氧化（FAO）、TCA循环、电子传输链（ETC）和呼吸，合成氨基酸、脂质、核苷酸、血红素和铁硫簇，以进行自身的抗氧化防御，并参与多个代谢途径，控制氧化还原稳态、信号传导、先天免疫和细胞凋亡等。线粒体功能障碍在多种情况的发生机制中非常重要，包括神经变性疾病(帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病)、心血管疾病、癌症、免疫，甚至老化过程。如，线粒体功能减弱是衰老的重要标志。

doi:10.1016/j.molcel.2016.02.011，线粒体作为生物合成和信号枢纽

一、线粒体结构

线粒体是具有双膜结构的移动细胞器，具有丝状和粒状结构。线粒体由线粒体膜和线粒体室组成，包括四个不同的域：外膜、内膜、膜间隙和基质。细胞器由两层膜包围，滑的外膜和明显折叠或管状的线粒体内膜，内膜具有较大的表面并包围基质空间。膜间隙位于内膜和外膜之间。

1）外膜（OM）

• 外膜是一个富含脂质的光滑表面，包含祖先的β-桶蛋白，如电压依赖性阴离子选择性通道(VDACs)/孔蛋白，这些蛋白使膜对高达10 kDa大小的分子具有通透性。40% 脂质和 60% 蛋白质，由于孔或孔蛋白的存在，可渗透。

• 外膜还包含主要只有一个跨膜结构域的α-螺旋膜蛋白，如MFF和MIRO，它们分别是线粒体分裂动力蛋白和运动机器的受体，强调了外膜在控制线粒体行为和细胞通信中的作用。

2）膜间空间(IMS)

• IMS是最小的隔室，仅包含线粒体蛋白质组的5%。尽管如此，IMS在促进蛋白质和脂质生物合成、金属稳态、氧化还原调节和氧化折叠、细胞凋亡以及线粒体动力学和结构方面起着关键作用。

3）内膜(IM)

• 内膜是真核细胞中蛋白质最密集的膜，高度不透性，并形成称为嵴（cristae）的结构。由20%的脂质和80%的蛋白质组成，为选择性渗透膜，由于膜向内折叠并有嵴存在，故称粗糙膜（嵴是无数的手指状突起，每个嵴中都存在网球拍状颗粒，这些颗粒之前被命名为内膜亚基 F0-F1 粒子、基本粒子或氧化体）。

• 内膜是线粒体的功能核心，包含电子传递链（呼吸链）和涡轮式ATP合酶机器，后者二聚化以形成和驱动嵴的形成。

4）线粒体基质

• 基质中进行大量的生物合成反应以及线粒体遗传系统。它是存在于内膜的内部的在半流体基质。线粒体基质是由内膜包围的液体（胶体）区域，含有三羧酸循环的可溶性酶氧化乙酰辅酶A产生CO2、H2O和氢离子。氢离子还原NAD和FAD分子，两者将氢离子传递到呼吸链或电子传递链，在此处发生氧化磷酸化，生成富含能量的ATP分子。线粒体的基质中还含有单环或双环和双链 DNA 分子（称为 mt DNA）以及 55S 核糖体（称为线粒体核糖体）。由于线粒体可以在自己的蛋白质合成机器中合成 10% 的蛋白质，因此它们被视为半自主细胞器。

• 它是三羧酸循环(TCA)的所在地，将营养物的碳骨架氧化为NADH和FADH2，这些还原当量被呼吸链用于产生用于ATP合成的化学渗透能量。

二、线粒体分裂方式

与损伤相关的分裂相比，细胞生长过程中的线粒体分裂是一个表示时机较好的标志。

不同的机制控制针对线粒体自噬和针对细胞生长的线粒体分裂。虽然已经有关于特定类型分裂的提示，但直到现在还缺乏明确的证据。绝大多数的线粒体分裂都需要DRP1蛋白。DRP1可以通过不同的方式被激活来驱动哺乳动物的线粒体分裂。这些方式包括：与线粒体DRP1受体（MFF、MID49、MID51和FIS1）相互作用；DRP1修饰（翻译后修饰）；与肌动蛋白细胞骨架（肌动蛋白丝）或线粒体脂质心磷脂相互作用；以及与各种细胞器接触，包括内质网（ER）、溶酶体和高尔基（以高尔基衍生囊泡的形式）。目前尚不清楚这些因素是导致单一的分裂途径还是不同的分裂途径。

利用超分辨率显微镜对线粒体分裂进行了仔细分析，定义了两种空间上不同的分裂类型。中区分裂（Midzone division）发生在这种细胞器的中心位置，而外围分裂（peripheral division）则发生在线粒体的两端（见下图）。这两种分裂类型在猴子Cos-7细胞中发生的频率相似，而中区分裂在小鼠新生心肌细胞中更为频繁发生。

doi:10.1038/s41586-021-03510-6

外围分裂和中区分裂具有本质上不同的特性。中区分裂发生在具有健康线粒体特征的细胞器中---它们不显示异常的迹象，如膜极化的减少或活性氧（ROS）水平的变化。相比之下，当这种细胞器的顶端出现了膜电位的降低和ROS的增加，它的其他部分明显缺乏这些改变时，就会发生外围分裂。此外，这种外围分裂的较小产物往往缺乏复制性的DNA---这是不健康线粒体的一种标志。

当线粒体受损时就会发生外围分裂，并且是线粒体自噬的前兆。事实上，外围分裂在暴露于各种细胞应激时增加，并与线粒体自噬的标志物的积累有关。相比之下，中区分裂在刺激细胞增殖的情形下增加。

三、线粒体功能概述

1）产能和代谢

线粒体是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所，共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化，三羧酸循环在会产还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）等高能分子，氧化磷酸化可以利用这些物质将氧气还原并释放能量合成ATP。

2）线粒体与细胞凋亡

线粒体在细胞凋亡过程中起着关键作用。线粒体在细胞凋亡中扮演着“信号放大器”的角色，半胱天冬酶是细胞凋亡的执行者，它们通过切割细胞内的关键蛋白，导致细胞结构破坏和功能丧失，最终引发细胞凋亡；线粒体通过调节细胞内的氧化还原状态来影响细胞凋亡；线粒体还与其他细胞器相互作用，共同调节细胞凋亡。

3）线粒体与细胞自噬

研究发现线粒体在细胞自噬过程中发挥着重要作用。细胞自噬是一种细胞内的降解过程，通过降解受损或多余的细胞器和蛋白质，维持细胞内环境的稳定。线粒体在自噬过程中既是被降解的目标，也是自噬过程的调控者。当线粒体受损或功能异常时，会触发自噬过程，通过降解线粒体来清除受损部分，维持细胞的正常功能。

4）线粒体与细胞衰老

线粒体部分亚群发生MOMP，不会诱导细胞死亡，但加速细胞衰老，这一现象被称为少数线粒体外膜通透性（miMOMP）。在衰老过程中，miMOMP导致线粒体DNA（mtDNA）通过BAK/BAX通道释放到细胞质中，激活cGAS-STING通路，进而促进SASP的发生。（doi: 10.1038/s41586-023-06621-4）

5）线粒体与细胞焦亡

线粒体损伤是细胞焦亡的关键，抑制线粒体损伤可以显著抑制细胞焦亡的发生。线粒体损伤释放的ROS会放大细胞焦亡；线粒体损伤释放的mtDNA可以激活AIM2炎症体，增强细胞焦亡；敲除Crls1和Plscr3后，发现IL-1β的释放也受到抑制，表明线粒体损伤可以增强IL-1β的释放；线粒体损伤促进细胞焦亡诱导体内抗肿瘤免疫；通过荧光原位杂交技术发现，线粒体损伤导致线粒体RNA外切酶PNPT1释放，引起全局mRNA降解，促进细胞焦亡的发生。（doi: 10.1016/j.immuni.2023.10.004）

6）线粒体与免疫反应

线粒体还参与免疫反应的调控。研究发现，线粒体可以释放一些信号分子，如线粒体DNA（mtDNA）和线粒体来源的囊泡（MVs），这些信号分子可以激活免疫细胞，引发免疫反应。此外，线粒体还与一些免疫相关疾病的发生和发展密切相关，如自身免疫性疾病、炎症性疾病等。

7）线粒体与神经退行性疾病

神经退行性疾病是一类以神经元结构和功能逐渐丧失为特征的疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等。研究发现，这些疾病的发生与线粒体功能异常密切相关。线粒体功能障碍会导致神经元能量供应不足、氧化应激增加等，进而引发神经元的死亡和疾病的发生。

8）活性氧产生与清除

线粒体是细胞内活性氧（ROS）的主要来源之一，但同时也具有清除ROS的机制。ROS在细胞信号传导和免疫反应中发挥作用，但过量的ROS会导致氧化应激和细胞损伤。

9）钙离子调节

线粒体可以摄取、储存和释放钙离子，对细胞内钙离子稳态起到调节作用。钙离子在许多细胞过程中起着重要的信号传导作用，包括肌肉收缩、神经递质释放和细胞凋亡等。

10）促进性腺发育

线粒体可以分泌大量的促进性腺发育的激素，如促卵泡生成素、促黄体生成素等，促进性腺的发育和成熟。

11）解毒功能

肝脏细胞中的线粒体具有对氨气（蛋白质代谢过程中产生的废物）造成的毒害进行解毒的功能，保护细胞免受损害。

线粒体的功能受到多种因素的调节，包括线粒体DNA（mtDNA）的表达、线粒体融合与分裂的动态平衡、线粒体质量控制机制（如线粒体自噬）以及与其他细胞器的相互作用等。这些调节机制确保线粒体的功能适应细胞的需求，并维持细胞的正常生理状态。

总的来说，线粒体在细胞的生存和功能中扮演着至关重要的角色。通过呼吸链、三羧酸循环和脂肪酸氧化，线粒体为细胞提供能量，同时还参与了细胞凋亡、细胞信号传导和细胞代谢平衡的调节。

四、线粒体分离方法

传统线粒体分离一般通过机械匀浆制备含有各种细胞器的匀浆，这一步的目的是破碎细胞膜释放细胞器。然后进行细胞器分选，一般根据不同细胞器的沉降系数不同，选择差速离心或者密度梯度离心法进行分离。

1、差速离心法

在低速下从整个细胞提取物中去除完整细胞，然后进行高速离心浓缩线粒体并将其与其他细胞器分离。

首先，（a，B）从安乐死的小鼠中整块取出肺。(c)用剪刀将肺组织切碎，并且（d）用BSA分离缓冲液洗涤4至5次以除去血液。(e)将样品用高速组织匀浆器匀浆，并再次用组织玻璃Potter-Elvehjem匀浆器小心地匀浆，以实现细胞破坏而不损害线粒体完整性（f）。(g)将匀浆在4°C下以700 g离心10 min。(h)丢弃沉淀物，收集上清液并进行差速离心。最后，（i）所得含有线粒体的沉淀物准备用于功能分析。

doi:10.3389/fphys.2021.748261，新鲜老鼠肺组织线粒体的分离

2、密度梯度离心

粗制线粒体组分可以通过差速离心法进行分离，如果需要，可以将它加载到不连续的Percoll密度梯度上，以获得纯线粒体。

离心管先装好密度梯度介质溶液（密度逐渐增加的、形成密度梯度的、高溶解性的、惰性物质溶液），再将样品小心的铺放在表面，离心时不同组分以不同的沉降速度沉降，从而形成不同的条带，达到分离的目的。

doi:10.1007/978-1-4939-6824-4_2，从培养细胞和小鼠组织中分离功能性线粒体

五、线粒体检测方法

线粒体功能障碍主要表现为线粒体形态、结构和功能异常，包括：线粒体异常体积、数量的增加或减少、线粒体膜电位异常，线粒体DNA损伤等。对于线粒体的检测，一是形态结构的检测；二是线粒体功能的检测及分析。doi:10.12677/ACM.2023.1392005

1、线粒体形态检测

线粒体是一种广泛存在于真核细胞内的双层膜细胞器，直径在0.5到1.0微米左右，一般呈短棒状和圆球状，其大小受细胞代谢水平限制，不同组织在不同条件下可能产生体积异常膨大的线粒体，例如胰脏外分泌细胞、神经元细胞和人成纤维细胞中的线粒体等。

1）电子显微镜

• 是观察真核细胞细胞器的重要工具，也是观察和分析线粒体结构的金标准。

• 不能清晰地区分线粒体和其他膜结构，同时也无法观察线粒体的动态变化。

2）原子力显微镜

• 新兴的观察方法，在分辨率和实时成像方面具有优势，并且可以在液体环境下观察线粒体肿胀等动态变化

• 但适用范围较小。

3）荧光共聚焦显微镜技术

不断提高，为线粒体结构观测提供了新的选择。在大多数情况下，显微镜可以用来观察和分析二维线粒体的形态和数量。

4）三维共聚焦显微镜

• 可以通过在3D水平观察特定标记的线粒体蛋白质来观察线粒体的形态。

5）宽视野荧光显微镜和高分辨共聚焦激光扫描显微镜

• 可用于线粒体形态变化的成像分析，特异性高于电子显微镜

• 但不能观察到线粒体的动态变化。

6）AiryScan显微镜

• 可以高速、高灵敏度地采集图像，有效地观察线粒体分裂、融合和自噬的动力学过程。

2、线粒体功能检测

1）线粒体膜电位（MMP）检测

线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP, Δψm)指线粒体内膜两侧离子浓度不同所产生的负电位差(−180 mV~−200 mV)，与细胞动态平衡密切相关，反映线粒体功能的完整性，是评价线粒体功能的敏感指标。MMP的变化甚至微量变化，都会极大地影响线粒体的功能。线粒体功能与细胞稳态密切相关，MMP的异常变化会进一步导致线粒体疾病。监测MMP是评估线粒体功能状态的常用方法。

doi:10.1093/ntr/ntaa177

目前常采用流式细胞术结合荧光染料探针来检测MMP。近年来，荧光共振能量转移分子对(fluorescent resonance energy transfer pairs, FRET Pairs)也用于MMP比率荧光监测。

值得注意的是，线粒体膜上不同部位的MMP差异很大。精准测量局部MMP变化的方法还需深入研究。

2）线粒体耗氧量测定

在所有细胞器中，线粒体消耗的氧气最多，这种氧气消耗往往反应线粒体的功能状态。常用氧电极极谱法检测线粒体耗氧量。这种方法在30℃的磁场搅拌培养箱中操作，通过在耗氧介质中孵育线粒体实现对线粒体耗氧的精确分析。简单地说，鱼藤酮用于抑制电子传递链中的复合体I，然后加入琥珀酸来测量线粒体的状态IV呼吸。线粒体呼吸状态是指呼吸底物及ADP以不同浓度存在时线粒体的呼吸速率。在呼吸底物和ADP都存在时的呼吸速率称为状态III呼吸；ADP被消耗殆尽但呼吸底物仍然剩余时的呼吸速率称为状态IV呼吸。状态III呼吸速率与状态IV呼吸速率之比，称为呼吸控制率(respiration control rate, RCR) ，RCR降低表示线粒体ATP合成受损和线粒体功能障碍，而RCR升高表示细胞活动旺盛和代谢加快。

doi:10.3791/58387，Cu、Mn和Zn补充剂对奶牛70天泌乳期肝线粒体耗氧量和产奶量的影响。

研究者也开发出具有自动或半自动化的线粒体功能分析仪，例如，Seahorse分析仪通过传感器测量溶解氧和酸碱度的变化，自动计算速率，提供细胞耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)和细胞外酸化速率(extracellular acidification rate, ECAR)的实时数据。

3）线粒体Ca2+检测

细胞内的Ca2+主要储存在线粒体和内质网等细胞器中，在信号转导、凝血、跨膜离子转运和细胞分裂等生物过程中发挥关键作用。而线粒体内的Ca2+对于调控ATP生成起着关键作用。Ca2+失衡可导致线粒体功能障碍，进而引起细胞损伤和死亡。线粒体内Ca2+积累促进ATP合成，减少则降低ATP水平。ATP合成受损进一步导致Ca2+失衡，可诱导机体内分泌功能障碍和疾病发生，如线粒体相关糖尿病的发生。因此，了解线粒体Ca2+的动态变化对研究疾病机制和治疗具有重要意义。

doi:10.1016/j.ceca.2017.05.003 ，线粒体（绿色）和内质网的免疫荧光分析

线粒体Ca2+的经典测定方法包括沉淀法、电化学法、EDTA螯合滴定法、火焰光度法和原子吸收分光光度法。其中，电化学法最方便，该方法利用化学电池在溶液中的电化学性质及其变化，可用于有机物和无机物的定性和定量分析，但易受钠、钾、磷和硫酸盐等物质干扰，适用于实时监测和光敏度要求不高的实验。随着免疫荧光技术的发展，Ca2+水平也可用荧光探针进行检测。

4）线粒体通透性转换孔（MPTP）检测

线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，具有高度选择性，是调控线粒体通透性的结构基础。此外，MPTP对细胞内离子浓度变化非常敏感，在细胞内信号转导系统中具有重要作用。MPTP的异常开放与Ca2+浓度的异常升高、氧化应激和mtDNA突变密切相关。MPTP适度开放可促进线粒体清除有害物质，持久开放则会导致不可逆损伤，诱导线粒体基质肿胀、内膜去极化、ATP水解等，最终导致细胞死亡或凋亡。

doi:10.1111/brv.12764 ，线粒体肿胀是线粒体通透性转换孔(mPTP)的经典标志。该图的上半部分显示了在体外诱导的线粒体肿胀与 MPTP有关。

检测MPTP的经典方法有膜片钳、分光光度法和活性物质标记法等。膜片钳方法是最早使用的方法，该方法通过记录离子通道电流来反映离子通道的活动，以评估线粒体的功能。

5）线粒体ATPs水平检测

ATP通常被认为是细胞的主要能量来源，而线粒体是ATP的主要产生场所。线粒体对外界环境刺激非常敏感，线粒体一旦受损，ATP生成减少，从而抑制许多细胞代谢过程，导致机体疾病发生。例如，帕金森病、心血管疾病和内分泌功能障碍等都与线粒体ATP生产减少相关。因此，ATP水平是评估细胞能量代谢和线粒体功能的关键指标。

测量ATP水平目前常用的技术包括经典层析法、高效液相色谱法、酶分析法和荧光检测法等。

doi:10.21769/BioProtoc.3599，测量ATP酶/激酶活性的两种偶联酶测定的示意图

6）线粒体呼吸链复合体的检测

线粒体呼吸链位于线粒体内膜上，由5个复合物组成，其中包括：复合物I (NADH-Q氧化还原酶)、复合物II (琥珀酸-Q氧化还原酶)、复合物III (UQ-细胞色素C氧化还原酶)、复合物IV (细胞色素C氧化酶)和复合物V (ATP合成酶)。其通过一系列的氧化还原过程最终形成ATP。对线粒体呼吸链复合体的检测方法包括：分光光度法、蛋白质印迹法、近红外光谱技术等。

分光光度法是检测线粒体呼吸链复合物I~V活性的主要技术，近红外光谱技术在线粒体复合体的非侵入性测量方面取得了很大进展。

7） ROS水平检测

线粒体是细胞内氧化磷酸化和产生ROS的主要场所。细胞内活性氧包括超氧阴离子自由基、过氧化氢及其下游产物。在生理条件下，细胞内抗氧化防御系统使自由基的产生和清除处于平衡状态。在病理条件下，细胞内抗氧化系统和氧自由基之间的平衡被破坏。当细胞内ROS水平过高时，线粒体结构和功能受损，细胞色素c通过MPTP释放，导致线粒体酶、脂类和核酸损伤以及氧化应激。此外，ROS可导致mtDNA碱基氧化和增殖异常，从而引起线粒体ATP合成减少和MMP下降。因此，线粒体的功能状态可以通过测量ROS水平来确定。