北京林业大学月季育种团队揭示月季关键致香组分及合成调控网络

花香被誉为花卉的灵魂，具有重要的观赏、生态和经济价值。随着生活水平的提升和消费观念的改变，人们已不能满足于常见精油种类，一直在探索具多功能新型天然植物精油新原料。此外，市场对于“玫瑰精油”的认识大多停留在“经典玫瑰香”，而中国特有香水月季的“茶香”鲜有人知。

2024年9月30日，国际知名高水平期刊Nature Communications在线发表北京林业大学月季育种团队题为“Multi-omics analyzes of  illuminate tea scent biosynthesis and release mechanisms”的研究论文，北京林业大学园林学院在读博士研究生周利君为论文的第一作者。于超教授、罗乐教授、张启翔教授和东北师范大学高翔教授为论文的通讯作者。

本研究通过构建原产我国的野生蔷薇属种质资源--大花香水月季超高质量基因组，解析了其茶香合成-释放的组织特异性和昼夜节律，提出了月季茶香特异性合成调控网络，为明确中国古老茶香月季在现代月季发展中的地位并找回中国月季独特花香提供了新的视角。迈维代谢为该研究提供了SPME-GC-MS代谢组以及转录组检测分析服务！

①成功构建了大花香水月季端粒到端粒的全基因组图谱，并通过与其他蔷薇属物种的比较基因组学分析，揭示了大花香水月季基因组的独特性质。这些高质量的参考基因组数据为蔷薇属的泛基因组研究提供了完整框架。

②结合感官评定、转录组、GC-MS挥发性代谢组检测，确认了大花香水月季的主要香气组成。通过对基因表达的时间序列共表达网络分析，发现苯类/苯丙烷VOCs合成路径中的基因及其产物是其香味的主要调控者。

③基于多组学数据绘制了不同生长阶段、不同时间和不同组织部位的香气图谱，构建其遗传信息数据库，明确了茶香特异性合成调控网络。

玫瑰香气驯化历史与展望

1.构建大花香水月季T2T基因组及泛基因组分析

作者首先构建了第一个完整T2T水平的大花香水月季基因组，由七条染色体组成，基因组大小为549.76 Mb（图1a、b）。此外发现了159bp的候选着丝粒重复序列，并被命名为CEN159卫星序列，代表大花香水月季（，简称RG）的着丝粒区域。这一区域与在中国传统月季“月月粉”品种（ ‘Old Blush’，简称RC）中发现的着丝粒卫星OBC22617长度相同。以CEN159单体作为探针的Oligo-FISH在RG的大多数着丝粒上显示出清晰且特异的信号（图1d、e）。作者共鉴定出13个端粒和1个45S rDNA端。虽然在3个组装版本的3号染色体末端没有发现端粒，但在该区域特异性检测到1198个45S rDNA位点(图1c)。这与拟南芥中发现的2号和4号染色体末端的短臂45S rDNA簇，以及人类端粒染色体短臂上的rDNA重复序列相似，并不是端粒。为了验证测序结果，作者使用FISH可视化端粒和45S rDNA序列，显示了3号染色体的两个姐妹染色单体上的45S rDNA位点(图1f)。基因组BUSCO完整性达到99.00%，QV值为60.53，表明本研究组装大花香水月季T2T基因组具有更高的组装完整性、碱基准确性。

图1大花香水月季的T2T基因组及着丝粒和端粒的鉴定

为了探究大花香水月季基因组的独特属性，作者基于5种蔷薇属物种、6种蔷薇科其他属代表物种、同为蔷薇超目模式物种的葡萄（）以及作为外群的单子叶植物深圳拟兰（）共13种271个单拷贝同源基因为基础，进行系统发育分析。在13种植物中，共鉴定出464,307个基因，并将其归为79,059个同源基因家族。在蔷薇科中，和较早与和分化。在蔷薇属中，物种出现的顺序为RP、RR、RG、RC和RW(图2a)。

蔷薇属内具有多样的表型特征变异，包括植物种类、花序、颜色和香味（图2b）。大花香水月季基因组与其他四种月季相比结构变异类型多，表明蔷薇属内存在显著遗传分化（图2c）。通过分析蔷薇属物种共有的同线性直系同源基因，作者找到了可能构成蔷薇属的核心基因集，具有1646个物种特异性基因家族，远超其他蔷薇物种，表明新获得的T2T基因组组装最完整，为构建高质量的蔷薇属泛基因组提供了最佳的框架，也为蔷薇泛基因组增添了丰富的序列多样性。野生物种中的等位基因对作物适应性特征至关重要，但在驯化过程中常丢失。因此，大花香水月季T2T基因组对于构建蔷薇属泛基因组和完善香气特性至关重要。

图2蔷薇科植物的进化与比较基因组分析

2.参与苯丙类生物合成的基因的扩增有助于茶香味的进化

大花香水月季的香气相关基因在苯类/苯丙烷类、萜类和脂肪酸衍生物途径中被识别和表征。苯丙烷/苯代谢途径中酶基因的串联或邻近复制较萜类途径更为频繁。对13种蔷薇科物种的系统发育分析表明，在大花香水月季的854个基因家族扩展中，3条与气味相关的途径显著富集。因此，作者重建了主要挥发性有机化合物(VOC)代谢途径，包括苯丙烷类/苯类和萜类的生物合成。根据与茶香相关的主要香气成分，两个分支通路参与了大花香水月季苯类化合物的合成，可能与茶香的形成有关。

在研究中发现了多个参与TMB和DMT合成的O-甲基转移酶（OMTs）。在‘月月粉’（‘Old Blush’）中，间苯三酚O-甲基转移酶（POMT）催化间苯三酚（PLG）的第一个甲基化步骤，生成3,5-二羟基苯甲醚（DHA）。在一个候选POMT的表达水平上，发现其在‘月月粉’中比在大花香水月季中高出30倍，这可能与‘月月粉’中高TMB合成和大花香水月季中低TMB合成有关。尽管和在氨基酸水平上相似度为96.5%，但它们在酚甲醚生物合成中表现出不同的底物特异性。可能从一个类似OOMT2的基因演化而来，其出现是中国月季香味合成进化的关键步骤。和都能有效地将间苯三酚甲基化为DMT，从而贡献于大花香水月季的特征性花香。在月月粉中鉴定出了四个OOMT旁系同源基因，但是只有两个表达量较高，这表明它们对应于和，并贡献于TMB合成。在大花香水月季中鉴定出了五个OOMT旁系同源基因，其中三个表现出特定的高表达（图3 a–c）。由于的表达与DMT的产生高度一致，因此它是大花香水月季中DMT合成的主要基因。

五个丁香酚合成酶（EGSs）在所有五种月季中被鉴定出来，EGS1与EGS2-EGS5基因簇分离，表明EGS1的基因重复发生在物种分化前（图3d-f）。大花香水月季高丁香酚释放与‘月月粉’低释放对比显示，丁香酚积累与EGS基因数量无关。通过基因表达趋势以及产物含量趋势，作者发现的表达水平远高于其他同源基因，表明它在丁香酚合成中起关键作用，而是大花香水月季特有的，主导异丁香酚合成，表明其在异丁香酚合成中扮演重要角色。

图3 蔷薇属候选基因的鉴定与进化分析

3.大花香水月季茶香气的组织特异性释放规律及调控网络

被子植物的花通过复杂特征吸引传粉者并提高觅食效率。矮牵牛（）和叉枝蝇子草（）的花的挥发性物质具有组织特异性和空间排放模式，蜜蜂利用气味梯度导航。因此，通过香气介导的植物-传粉者互利共生可能显著影响作物产量。作者通过感官评价发现，在大花香水月季中，花瓣、雄蕊和雌蕊香气最浓，且香气强度与红色深浅相关，表明香气梯度指向生殖器官。花瓣挥发物主要在表皮产生，其特征为独特的锥形细胞。香气释放存在水平和纵向差异，例如在晚香玉（）中，腹面挥发性物质释放量是背面的20倍。大花香水月季花瓣的腹面表皮细胞呈锥形，而背面表皮细胞平坦，表明表皮上的释放环境不同（图4c），但两者都能产生香气挥发物。

在筛选出的48种香气挥发物中，β-榄香烯为叶片特有，而雄蕊中缺乏异丁香酚等4种化合物。辛酸甲酯和癸醇主要在绿色无味组织中检测到。挥发物在不同组织中含量差异显著，花瓣中DMT等物质含量较高，雄蕊则具有茴香醚等特异性物质。绿色叶片通过释放特定挥发物欺骗性吸引捕食性黄蜂，而萼片则释放大量的脂肪酸衍生物。

丁香酚衍生物在大花香水月季中是主要香气成分，不同组织中分布各异，雄蕊中丁香酚含量远高于其他组织，异丁香酚和甲基丁香酚分别在花瓣和雌蕊中富集。基于与丁香酚表达模式相似的表达模式，作者确定了两个共表达模块。在雄蕊特异模块中，通过13个转录因子（TFs）在丁香酚积累中发挥关键作用。在雌蕊特异模块中，被鉴定为核心基因，它与一个C4H基因和12个TFs相互作用，形成了一个参与雌蕊中甲基丁香酚合成的调控网络（图4d）。

图4 香味释放的空间格局和高度组织特异性

4.大花香水月季茶香气的时序释放节律及调控网络

为了确定大花香水月季茶香气释放的昼夜节律，作者从凌晨0:00（花蕾期）至晚上20:00（盛开期）期间，选取了六个时间点进行观察（图5a）。值得注意的是，癸醇和对羟基苯乙酮在00:00–08:00期间未被检测到，但在12:00–20:00期间则挥发出来（图5b）。在基因表达层面，0:00与8:00之间的差异表达基因（DEGs）数量极少，而从8:00至12:00，观察到差异基因数目较多，这与VOC含量和传粉者数量的变化趋势相吻合。植物通过释放VOCs来吸引传粉者和防御者，从而确保繁殖成功。

除此之外，转录因子、酶基因和挥发物表达水平之间的时间滞后现象。通过构建时序基因共表达网络（TO-GCN），分析了香气化合物的调控机制。TO-GCN由九个时间顺序级别组成（图5c中的L1至L9），与转录因子在六个时间点的表达时间顺序相匹配。香气释放过程中的发育转变被明确划分为三个时期：初期（对应T00-T08和L1-4）、过渡期（对应T12和L5-6）以及末期（对应T16-T20和L7-9）。在初期过程中，超过80%的来自苯丙烷/苯类和萜类途径的挥发物被释放，而来自脂肪酸衍生物途径的挥发物则在整个过程中均有分布。TO-GCN揭示了大花香水月季开花过程中挥发性物质与基因之间的调控关系，找出了调控主要挥发性物质的关键基因和TFs（图5c）。

特别地，在L2与异丁香酚的合成密切相关，但其上游调控因子尚不明确。因此，作者选择作为研究对象，以识别其上游调控因子。通过TO-GCN，预测了的直接调控因子。根据最终的层级网络分析，bZIP和C2H2被确认为的直接调控因子，而包括MYB、NAC、WRYK和bHLH家族在内的29个TF基因则作为的中间二级调控因子（图5d、5e）。

图5 一天中与月季香味相关的VOCs和TO-GCN

6.大花香水月季茶香气的物种特异性挥发性有机化合物及调控网络

为了确认香气差异，作者将大花香水月季（图6a）和‘月月粉’（图6i）与七种月季香气标准进行比较，结果发现 ，大花香水月季具有更强的茶香和更高的挥发物积累，并且香气和挥发物具有在花蕾至初开阶段上调，半开至全开阶段下降的趋势（图6c, g）。大花香水月季的主要香气挥发物包括丁香酚、DMT、甲基丁香酚、(E)-异丁香酚、2-苯乙醇、芳樟醇和(E)-β-紫罗兰酮（图6b）。相比之下，‘月月粉’的主要成分是TMB、2-甲基丁醇-1、β-榄香烯、α-杜松醇、卡拉烯、γ-杜松烯和1S-β-松烯（图6h）。茶香主要是由苯/苯丙烷途径产生的VOCs组成，正如大花香水月季中特定上调的DMT、丁香酚、甲基丁香酚和(E)-异丁香酚所证明的那样，这与大花香水月季特有的基因家族扩张一致。

图6 花期挥发性有机化合物释放与时序基因共表达网络

为了探究香气差异的调控基因，作者构建了大花香水月季和‘月月粉’的时间序列基因共表达网络（TO-GCNs）。获得了两种特定于物种的TO-GCNs（RG-和RC-特定的）以及一致的TO-GCN（图6e）。根据与花香表达模式相关的特征，时序子网络可以被划分到三个主要过程：初始阶段（S1，对应于RG-GCN的L1–L3和RC-GCN的L1–L2，此时花瓣未开放且香气较弱）、过渡阶段（S2-S3；对应于RG-GCN的L4–L5和RC-GCN的L3–L5，此时香气增强）和终末阶段（S4–S5；对应于L6–L7，此时香气减弱）（图6d, f）。‘月月粉’的重瓣花释放时间晚于RG的单瓣花，且初始阶段VOCs少而基因多，表明挥发物排放与基因表达有时间滞后。初始阶段两种月季间许多基因共表达（图7a），并且在苯丙烷/苯类子网络中，分别在三种不同的网络识别出不同数量的酶基因（图7b）。在过渡阶段，RG-特定GCN苯丙烷/苯类子网络的酶基因数量（26个）远超RC。除此之外作者还发现RG的主导转录因子家族为和，而RC为和。

作者通过研究物种特异性网络，综合预测了关键的调控和酶基因及其层级调控。酶基因和转录因子之间的差异阐明了大花香水月季中DMT相对于‘月月粉’中TMB的特异性高释放。位于RG-特异性GCN中的和在DMT合成中扮演重要角色。并且通过预测网络，作者发现和表现出层级调控，涉及作为第三调控者的三个转录因子基因（和）、作为中间二级调控者的四个转录因子基因（和）以及作为直接调控者的两个转录因子基因（）（图7c）。并且作者通过qPCR、序列比对、聚类等手段验证网络准确性。此外，RgMYB091-like1调控RgOOMT1启动子，这一点也通过原生质体双荧光素酶分析进一步验证。总的来说，这些调控网络为深入研究月季茶香分子机制提供了参考。

图7 大花香水月季以及月月粉香气代谢通路子网络

研究基于多组学，全面解析了大花香水月季基因组，构建了其不同组织、不同开花阶段和不同时间的香气图谱和遗传信息数据库，揭示了茶香的关键致香组分及其关键基因的合成调控网络，为茶香月季的保护和研究提供重要的遗传资源，为解析形成蔷薇属独特花香的遗传和变异机制奠定理论基础，为进一步提升月季的芳香品质，助力我国花卉分子育种和定向改良提质增效提供了技术支撑。