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对于低含量的目的细胞,知道其大致比例,有助于确定流式分析、分选实验流程中的许多关键要素,如:
①需要染色的样本总量
②上流式时需要采集的细胞总数
③配色时染料的选择
④分选时纯度、得率、活性和时长的权衡
以下整理了人外周血、小鼠、大鼠各细胞亚群比例,在科研根号三公众号回复“实验13”可下载这些数据的EXCEL表格。
这些数值仅供参考(所有显示的百分比是每个样本中各细胞亚群占白细胞总数的百分比)。可能会因样品制备、个体差异和所用动物的品系而异。
表1-人外周血各细胞群比例
表2-小鼠各细胞群比例
表3-大鼠各细胞群比例
关于需要获取的事件数量,建议使用泊松统计,它定义了给定数量的事件将在固定的时间/空间间隔内发生的概率,假设这些事件将以已知的平均速率发生,与从先前事件经过的时间无关。对于流式的稀有细胞检测:N为总事件数,R为目标细胞如阳性细胞数,P为目标细胞比例,则为P = R / N,0≤P≤1。方差定义为:Var(R)= NP(1- P)。标准差SD是方差的平方根,CV是等于1/SD即1 /Var的平方根*100%。应用举例,如检测PBMC中的B细胞,健康个体中,CD19+B细胞比例为10%左右,因此:P = 0.1,N=5000时,计算得CV=4.71%,一般建议CV保持在5%以下,因此获得5 000个事件也已足够。若获取10000个总事件,则CV=3.33%。保持达到一定的CV值,目标细胞比例越低,需要获取的总事件数越多。
下图显示了特定细胞稀有度比例对应的变异系数(CV)值。CV与阳性事件的数量有关,并定义为标准偏差 /平均值。
通常,更低的CV代表更好的实验精确度和可重复性。使用此表,如果可以接受较宽的CV,则细胞比例为0.1%的10,000个事件就足够了。但是,CV为10%时需要100次阳性事件,现在您可以看到10,000个事件数只有当目标细胞比例在1%以上的范围内CV值才能达到比较好的状态(<5%)。对于非常稀有的细胞群体(万分之一乃至十万分之一),要达到10%的CV就需要收集100万甚至1000万个事件。若以每秒10,000个事件的速度进行收集,收集1000万个事件将花费1000秒即16分钟。
细胞频率也是选择荧光基团时的一个因素。对于低密度抗原,建议选择明亮的荧光基团,但对于稀有细胞,也建议选择明亮的荧光团,因为阴性群体中的背景染色可能会掩盖其荧光。最后,在进行细胞分选实验时,细胞群的频率可能会影响分选。将需要有足够的起始材料来为下一次实验分选足够数量的细胞。此外,细胞频率也会影响收集足够细胞所需的时间;如果对细胞进行分选所需的时间过长,则可能需要降低纯度。
1、为什么建议磁珠分选而不是流式分选?
1) 磁珠分选需要的设备简单,而流式分选需要配备分选型流式细胞仪,价格较为昂贵,而且流式分选对于操作员的技术要求很高,需要专门的培训并有一定的经验后才能很好地完成流式分选;
2) 磁珠分选所需要的时间远小于流式分选所需要的时间;
3) 磁珠分选对于目的细胞的刺激比流式分选要小,流式分选过程中需要对目的细胞所在的液滴通电,并且需要经过一个强电场的区域,对目的细胞的刺激相对较大;磁珠分选只是让细胞处于一个低磁场中,基本可以忽略对细胞的影响,从保持细胞活力的方面考虑,磁珠分选要优于流式分选。
因此,如果磁珠分选可以满足实验需求时,应尽量选择磁珠分选的方法。
2、 磁珠分选为什么要求细胞活性越高越好?
1) 死细胞分泌DNA,DNA有粘性,会将磁珠标记细胞和非标记细胞粘在一起,如果是阳选会影响纯度,如果是阴选会影响得率。
2 )细胞活性低时可能会影响抗原抗体的结合效率。
3、 磁珠分选buffer是什么?
autoMACS running buffer(自己配制:pH7.2 PBS,0.5%BSA、2mM EDTA,如需无菌,建议购买商品化buffer或紫外线照射,不建议高温高压灭菌)。
4、 如果想分选的细胞有多个阳性marker怎么办?
可以选择磁珠分选阴选+阳选的方法
eg.分选小鼠脾脏naive CD4+T可以先用阴选的方法分到CD4+T细胞再用CD62L磁珠阳性分选;也可以用磁珠+流式的方法。
5、 分选柱可以二次使用吗?
不建议,主要是分选柱内填充的铁珠在使用后易生锈。
6、 分选柱应如何选择?
不同的试剂盒对于MS/LS/LD柱的最大细胞上样量和最大磁性细胞吸附量是不同的,建议一定要参考说明书;
此外,如分选的目的细胞较大(eg.巨核细胞或fibroblast),可考虑采用large cell colums。
参考文献
1.https://mp.weixin.qq.com/s/oaPitQKCRj8HTHrqJLMr2w
2.https://mp.weixin.qq.com/s/J8e5SaMAFwJ6LBYmYXG1xg
3.https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry.html
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