基因调控必备工具—逆转录病毒科病毒载体

1、逆转录病毒

       逆转录病毒（Retrovirus）是一类单链RNA病毒，含有逆转录酶，病毒进入宿主细胞后可将病毒的遗传物质RNA逆转录为DNA，随后通过病毒自带的整合酶等将病毒DNA整合到宿主细胞基因组中。逆转录病毒的这一过程使得其基因组能够永久整合到宿主细胞基因组中，实现长期稳定的表达，这一特点使其特别适合开发为基因治疗的载体。另外同样关键的一点是，大部分的病毒基因组可被感兴趣的基因所取代。那么，目前常见的逆转录病毒载体有哪些？各自又有什么特点呢？小恒今天给大家分享一下。

2、逆转录病毒载体种类

       逆转录病毒科由两个病毒亚科、六个正逆转录病毒属和四个泡沫病毒属组成，其中被设计开发为基因传递载体的包括慢病毒、γ-逆转录病毒、泡沫病毒和α-逆转录病毒。慢病毒主要是基于人类免疫缺陷病毒（HIV-1）进行改造的，关于慢病毒载体我们前面已有全面详细的干货介绍，因此这次不多做赘述。本文主要跟大家分享下其他三种逆转录病毒载体的相关内容。

3、γ-逆转录病毒（γ-retroviral）

       目前提到的逆转录病毒载体通常是指γ-逆转录病毒载体，主要开发于Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV，MMLV）。MMLV是一种简单的γ-逆转录病毒，其基因组包含三个逆转录病毒的三个核心基因：gag、pol和env；核心基因两侧是长末端重复序列（LTR），有助于将病毒基因组整合到宿主基因组中。构建重组MMLV时，为了避免产生具有复制能力的逆转录病毒，因此有必要将编码结构和蛋白酶的gag/pol基因、以及编码包膜蛋白的env基因进行分体式包装设计，即与慢病毒载体的包装系统类似，设计相应的包装质粒和包膜质粒，目的基因则构建在穿梭质粒上。由于MMLV的基因组比较简单，因此不需要像HIV-1慢病毒那样在包装质粒上加入额外辅助基因。MMLV包装过程与HIV-1慢病毒类似，包装细胞也是用293T细胞。

       MMLV载体有不同的种类，主要区别在于env基因表达包膜蛋白不同，对于不同细胞类型有不同的感染效率，分为亲嗜性包膜（即eco包膜，针对小鼠或大鼠细胞）、两嗜性包膜（可感染包括人在内的大多数哺乳动物细胞）等。两嗜性包膜在感染人T细胞方面比较突出。此外，科研人员将水泡性口炎病毒的糖蛋白（VSV-G）对MMLV载体进行改造，使其感染能力更为广泛，载体更稳定。

       MMLV载体的一个主要局限性在于与慢病毒相比，MMLV载体仅适用于感染分裂细胞，对于非分裂细胞不能将其基因组整合到宿主细胞基因上。这是由于MMLV缺乏核转运蛋白元件，逆转录的病毒DNA无法穿过核膜，所以目的细胞必须积极进行有丝分裂，利用核膜破裂期将病毒DNA运输至细胞核中，实现外源基因的稳定表达。另一方面，MMLV整合宿主基因组的主要位置偏好于转录起始位点附近、启动子近端以及CpG岛两侧，这可能促进原癌基因的激活进而诱发肿瘤的发生。

       事实上，MMLV载体在胚胎干细胞（ES）和胚胎癌细胞（EC）中没有活性，其中可能是由于DNA甲基化、缺乏增强子功能以及5’LTR启动子区域的转录沉默等机制导致的。为此，科研人员开发了鼠干细胞病毒（MSCV）载体，它在ES和EC中都具有活性，此外也可实现在造血干细胞中表达外源基因。MSCV载体来源于基于小鼠PCC4细胞传代骨髓增生性肉瘤病毒（PCMV）的突变体小鼠胚胎干细胞病毒（MESV）与MMLV的结合改造，对5’LTR和包装信号进行了修饰突变，使得MSCV能够适用于在ES、EC以及造血干细胞中表达外源基因。MSCV载体的包膜有多种选择，包括MLV的嗜亲性包膜、两嗜性包膜以及VSVG包膜，VSVG包膜可形成稳定的病毒颗粒，并可通过超速离心进行浓度进而得到高滴度的病毒。

4、泡沫病毒（Foamy Viruses）

       泡沫病毒是逆转录病毒科的一员，是一种复杂的逆转录病毒载体，拥有逆转录病毒中最大的基因组，约为11kb左右，其中除了常见的gag、pol和env基因外，还包含bel1至bel3等三个开放阅读框。泡沫病毒在宿主体内以及人类的感染案例中均未表现出致病性，因此作为基因治疗载体具有潜在的安全性优势。

       目前常用的泡沫病毒载体来源于人泡沫病毒（HFV，也称为SFV cpz的原型株PFV），这是猴泡沫病毒的(SFV)一个变种。HFV对于人类也是不致病的，属于理想的基因治疗载体。然而，在开发为载体的过程中，出于安全考虑，将HFV载体中3’LTR的U3区域进行大量删除，包括病毒启动子和增强子元件，以减小整合基因组后可能对原癌基因表达的激活等。外源基因序列则通常插入到CAS-Ⅱ和CAS-III之间。同样地，HFV载体的包装系统也是三质粒系统，分为包装质粒、包膜质粒和穿梭质粒，293T细胞作为包装细胞。包毒方案经优化后，重组HFV载体最高滴度可达1×107 TU/mL。

       HFV载体被证明对于神经元祖细胞、胚胎干细胞和造血干细胞的感染能力较好。HFV载体对宿主基因组的偏好有所不同，主要倾向于插入到转录起始位点附近的CpG岛。

5、α-逆转录病毒（α-retroviral）

       α-逆转录病毒是最初发现的一种致癌病毒，在100多年前就已经有描述其存在。α-逆转录病毒的致癌作用主要是由于遗传毒性，即病毒基因组的整合导致宿主原癌基因表达上调。应用最广泛的α逆转录病毒载体系统是RCAS（replication-competent avian leukosis virus LTR with a splice）系统，这是基于Rous肉禽病毒（RSV）。RSV载体的也是三质粒包装系统，以293T细胞为包装细胞，但得到的病毒滴度较低。将包装质粒的病毒基因进行针对人的密码子优化后，即可得到1×107 TU/mL的病毒滴度。RSV载体的理论包装容量约为8.8 kb，对于宿主基因组的整合位置对转录起始位点或启动子区等位置没有倾向性，是比较有优势的整合模式。

       关于逆转录病毒载体的介绍就到此结束了，每种载体都有各自的特点，适用的感染范围也不太一样，但目前用得最多的还是慢病毒载体，包装系统及应用方面更为成熟。当然，大家还得根据自己的实验设计来选择合适的病毒。汉恒生物专注病毒包装十余年，拥有丰富的实践经验，可提供eco包膜和VSVG包膜的MMLV载体，前者主要适用于小鼠和大鼠，后者适用于人、小鼠和大鼠，有需求的小伙伴可与我们联系咨询。

参考文献

[1] Maetzig T, Galla M, Baum C, Schambach A. Gammaretroviral vectors: biology, technology and application. Viruses. 2011;3(6):677-713. 

[2] Lindemann D, Rethwilm A. Foamy virus biology and its application for vector development. Viruses. 2011;3(5):561-585. 

[3] Suerth JD, Labenski V, Schambach A. Alpharetroviral vectors: from a cancer-causing agent to a useful tool for human gene therapy. Viruses. 2014;6(12):4811-4838. Published 2014 Dec 5.