Cancer Cell(IF:48) | 胶质母细胞瘤进化的综合蛋白质组学特征

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是多发于成人中的原发性脑肿瘤，目前预后中面临较大阻碍的是肿瘤的复发。由于肿瘤异质性的复杂性和对治疗后进化驱动的了解有限，复发性GBM的治疗未得到有效解决。为应对这些挑战，该研究对123例匹配的原发性和复发性GBM进行了全蛋白质基因组学分析，发现神经元程序的激活是治疗后肿瘤复发的主要机制。综合多组学分析揭示了WNT/PCP通路和BRAF激酶的激活是复发性GBM中神经元转移的分子决定因素。本研究为GBM患者的肿瘤复发提供了全面的见解，为临床诊断和治疗提供有希望的治疗策略参考。

2024年3月，韩国国立癌症中心研究所Kyung-Hee Kim课题组在Cancer Cell（IF：48.8）发表的题为 “Integrated proteogenomic characterization of glioblastoma evolution ”的研究成果，通过外显子测序+转录组学+蛋白质组学+磷酸化蛋白质组学+单细胞转录组学研究方法，发现WNT/PCP通路和BRAF激酶的激活标志着分子向神经元状态的转变。揭示了在治疗过程中，复发性胶质母细胞瘤神经细胞状态的演变。

发表期刊：Cancer Cell

影响因子：48.8

研究材料：

GBM组织样本（123例）：原发性组；复发性组

体外细胞模型：原发性组；复发性组

小鼠模型脑组织：替莫唑胺（TMZ）治疗组（n=4，时间点：T7/T18/T27/T34/T41）；安慰剂组

运用的技术方法：

全外显子测序（WES，n=122）

全转录组测序（WTS，n=86）

蛋白质组学（n=105）

磷酸化蛋白组学（n=105）

单细胞转录组学（n=4）

免疫印迹法、免疫荧光

1. 纵向胶质母细胞瘤的分子轨迹

研究基于收集的123个匹配的BGM样本，通过全外显子测序、全转录组测序、蛋白质组学、磷酸化蛋白组学进行分析。综合各组学结果发现原发性和复发性肿瘤间几个基因发生了显著改变，包括CDK6、MDM4和CCND2的染色体扩增（图1C-D），这些基因主要参与细胞周期和增殖。复发性GBM的标志是神经元分化促进基因SGK2、LIN7B、STX1A和CDK5出现功能性扩增（图1E）。表明细胞增殖可能是治疗前GBM肿瘤发展的驱动力。结果推测复发的GBM可能不再通过传统的增强细胞周期进程和增殖的机制维持。经过标准治疗后，复发性GBM获得了不同于细胞周期和增殖能力，或可能涉及神经元活动的选择。

图1 纵向胶质母细胞瘤的分子轨迹

2. EGFR基因改变对复发性GBM下游信号传导的影响

GBM进化过程中基于蛋白水平研究关键的致癌信号通路，发现FGFR2/3、NTRK2/3和BRAF蛋白在复发性肿瘤中富集，而EGFR、CDK4和CDK6蛋白丰度在原发性肿瘤中增加（图2 A）。这些致癌蛋白的积累与基因拷贝数和mRNA水平的相应变化无关，表明些蛋白激酶在GBM进化过程中可能受到转录后调控。

目前已有研究报导EGFR在原发性GBM中的重要功能作用，但其在推动GBM复发中的作用尚不明确。研究人员将患者分为：一组在原发性和复发性肿瘤中均表现出EGFR改变，另外两组中复发性肿瘤的EGFR水平增加或消失（图2 B）。复发时维持EGFR改变的肿瘤中EGFR丰度和磷酸化减少，表明翻译后机制在进化过程中发挥作用以减弱EGFR信号传导（图 2D）。为研究EGFR对信号的影响，基于蛋白组学结果分析，EGFR通过两个主要的下游信号通路PI3K-AKT-PTEN-mTOR和RASRAF-MEK-ERK来执行致癌活性。在GBM的进化过程中，EGFR信号通路在很大程度上被失活，可能是由于在演变过程中EGFR蛋白减少的结果。

图2 复发时EGFR基因组改变对下游信号传导的影响

3. 纵向GBM的蛋白质组学特征揭示了复发时神经元活性的增加

为探讨复发性GBM中的生物学特征，通过蛋白质组学和磷酸化蛋白组学来分析配对GBM，发现在复发性GBM中SNAP25、TUBB4A、NELF、DAAM1/2、STMN1和MBP等蛋白表达增加（图3 A）。通路富集分析表明，复发性肿瘤的特征是参与神经元结构和功能以及突触形成有关蛋白和磷酸化蛋白的升高。原发性GBM主要富集于DNA复制、细胞增殖、促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）调控以及细胞外基质功能和EGFR信号通路（图3 B-C）。

通过整合转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白组学数据，发现在复发性GBM中，大多数蛋白与相应mRNA呈一致变化，部分蛋白与mRNA的变化不一致（图3 D）。富集分析表明复发时增加的蛋白和磷酸化蛋白与突触形成、GTPase活性和氧化磷酸化显著相关。与细胞分裂、mRNA加工和转录相关的蛋白质和磷酸化蛋白在原发性GBM中表达更丰富（图3E）。发现EGFR蛋白和磷酸化的丰度显著下降，结果揭示EGFR的变异在GBM肿瘤发生中发挥作用，但不是肿瘤进化中的必需（图3F-G）。总之，结果表明复发性GBM具有独特的神经信号，可能受RAS和WNT信号激活驱动的，并有助于使原发性GBM发展必需的细胞增殖机制失效。

图3 纵向GBM的蛋白质基因组学特征显示复发性GBM的神经元活性增加

4. 综合多组学分型显示复发时神经元GBM亚型的富集

研究应用基因组学、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学对原发性和复发性GBM进行了综合分析。大体分为四种肿瘤亚型，与神经发育和代谢两种功能分支有关（图4 A）。结果显示，复发性GBM在神经元亚型方面显著富集，表现出与原发性肿瘤不同的分子特征。这些结果表明复发性GBM在治疗过程中呈现向神经元状态演变的趋势，其调控受到遗传和遗传后分子事件的共同调控。

通过对队列样本的多组学分析，进行无监督聚类，与神经元特征有关的簇多集中于复发性样本。研究验证了复发性GBM主要表现出增强的神经元功能。通过对DNA修复机制关键分子的蛋白质丰度分析（图4 D），推测蛋白质失活可能是导致GBM复发的重要机制之一（图4 E）。

图4 整合多组学聚类揭示了复发GBM在诊断时向神经元状态的转变

5. 单细胞分析和功能实验模型揭示了复发肿瘤细胞中神经元活性的丰富

为评估复发性肿瘤中神经元和突触活动富集是肿瘤细胞固有而不是来源于肿瘤微环境，研究人员对4个配对的原发性和复发性肿瘤组织进行了单细胞RNA测序（图5 A-B）。复发性肿瘤中少突胶质细胞和神经元增加，而骨髓细胞和T细胞减少（图5D和5E）。基于通路功能分析复发性GBM的进化轨迹，发现复发GBM的演变过程中神经元细胞状态增加，而增殖细胞/祖细胞状态和线粒体减少（图5 F-G）。结果表明神经元活动是复发性肿瘤的主要生物学特征（图5 H）。

图5 单细胞分析揭示了复发性GBM中神经元状态和肿瘤微环境中神经元和少突胶质细胞的增加

为验证对于复发性GBM的神经发生和突触形成，研究者将标记有GFP的原代和复发性GBM患者来源的肿瘤细胞与小鼠皮质神经元一起共培养，建立体外模型。与原发肿瘤相比，复发性GBM肿瘤细胞的数量和突触前数量显著增加（图6 A），表现为较长的神经突起（图6 B）。复发肿瘤在肿瘤核心区域表现出更高水平的DAMM1表达（（神经元发育的标志物），并在浸润边缘观察到显著升高（图6 C-D）。表明神经发生和突触形成可作为复发性GBM的关键标志的作用。

 图6 复发性GBM中突触活性增强的功能验证

6. 利用体内模型系统模拟复发时神经元转移并对BRAF进行临床前治疗靶点测试

为研究神经元复发性GBM进化轨迹中转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组的动态调控，研究人员使用治疗后接受神经元转移患者的肿瘤细胞建立了模型，对小鼠颅内注射肿瘤细胞后后，用替莫唑胺（TMZ）或安慰剂处理小鼠。第7-41天收集GBM样本进行多组学分析（图7 A）。TMZ治疗显著延长了小鼠的总体存活期（图7 B）。通过多组学结果，在TMZ治疗后（T34）与突触结构和组织相关的神经元特征显著富集（图7 C）。免疫荧光结果证实与安慰剂治疗相比，TMZ治疗后DAMM1表达更高。

图7.复发时神经元过渡的体内模型

为确定复发性GBM中驱动神经元转化的潜在治疗靶点，建立了原发性和复发性GBM特异性的激酶-底物的互作网络。发现BRAF是GBM向神经元状态进化过程中驱动神经元的活跃激酶之一（图A-B），BRAF抑制剂可以抑制复发性GBM的神经元特征转化，可作为有用的治疗工具。

图8  BRAF是GBM进化的关键治疗靶点

研究通过对匹配的原发性和复发性GBM组织、PDX小鼠模型和体外实验的分析表明，GBM在治疗下的进化主要涉及获得向神经元细胞状态突触激活的特征。这种转变与WNT/PCP信号的多水平激活、DAMM1的显著增加和BRAF活性的有关。

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文本采用了蛋白质组学+基因组学+转录组学的多组学分析后，发现神经元程序的激活是驱动GBM复发的关键机制，而WNT/PCP通路和BRAF激酶的激活则是这一过程中的分子决定因素。这些发现全面揭示了胶质母细胞瘤演变和耐药的生物学机制，为GBM复发的诊断和治疗提供了新的工具。

原文链接 DOI:10.1016/j.ccell.2023.12.015

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