eDNA技术监测河流无脊椎动物的局限性：传统方法依然不可替代
本文来源于“海洋与湿地”（OceanWetlands）：
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译者：王芊佳
本文约8100字，阅读约16分钟
随着全球水体污染、栖息地丧失和气候变化等问题的加剧，监测水生生态系统的健康状况变得越来越重要。河流中的大型无脊椎动物（如昆虫幼虫、软体动物等）是水体生态环境的关键指示物种，它们的多样性和丰度能够反映出水质的变化以及生态系统的健康状态。因此，准确、及时地监测这些物种，对于水资源管理和保护具有重要意义。传统的监测方法，即通过直接采样并进行形态学分析，虽然可靠，但耗时费力、技术要求高，且需要经验丰富的分类学专家进行物种鉴定。此外，这种方法通常具有一定的局限性，无法检测到那些体型较小或难以捕获的物种。因此，寻找一种更为高效、全面的监测手段成为科学家们迫切需要解决的问题。正是在这种背景下，eDNA技术逐渐进入科学家的视野、并且走向广泛应用起来。
2024年6月7日，英国埃克塞特大学的生物科学研究团队在《环境科学总览》期刊上发表了一项研究，探讨了环境DNA（eDNA）技术在河流大型无脊椎动物监测中的有效性。这项研究分析了eDNA技术与传统形态学方法相比的优劣，并指出了该技术目前的局限性。
eDNA技术近年来逐渐成为生态监测领域的热点，它通过从环境中提取DNA片段来推测物种的存在，具备非侵入性和高效采样的优势。相比之下，传统的形态学方法，主要还是依赖于直接采集无脊椎动物样本并进行物种鉴定，虽然过程复杂，但结果准确性较高。这项研究旨在评估eDNA在河流生态系统中对大型无脊椎动物的监测效果，尤其是与传统形态学方法相比，eDNA能否提供足够全面的信息。
研究结果显示，尽管eDNA技术具备潜力，但在实际应用中，其检测到的无脊椎动物种类明显少于传统形态学方法。特别是，eDNA的检测在某些重要的动物门类中表现不佳。例如，线虫门、扁形动物门、刺胞动物门和线形动物门的物种未能通过eDNA技术检测到。此外，即便是节肢动物门中，也有超过100个物种未被eDNA识别，进一步表明了这项技术在全面物种检测方面的不足。
在该研究中，研究人员对多种基因标记和PCR引物组合进行了评估，发现COI基因标记及其对应的mlCOIintF/jgHCO2198引物组合是目前最有效的组合，能检测到更多的无脊椎动物物种。但是，即便是使用了这一引物组合，仍有部分物种未被发现，表明eDNA技术在某些特定分类群的监测中效果不佳。
该研究还指出了其他影响eDNA应用的因素。例如，不同物种的DNA在环境中的稳定性差异，部分物种在环境中释放DNA的能力不同，以及上游DNA来源可能引发的“假阳性”结果。此外，许多无脊椎动物的基因序列数据在数据库中尚不完备，进一步限制了eDNA技术的应用广度。
该研究团队认为，尽管eDNA技术具有巨大的发展潜力，但目前还无法作为监测河流无脊椎动物的独立且可靠的方法。特别是在全面评估河流生态系统健康状况时，eDNA技术的局限性可能导致关键物种的遗漏。为了弥补这一不足，未来的研究应着重于完善基因序列数据库，尤其是针对线虫门、扁形动物门、刺胞动物门和线形动物门等尚未充分覆盖的物种。此外，还需进一步开发更有效的引物和基因标记，以确保能检测到更多重要的分类群。
研究作者团队指出，在当前阶段，eDNA技术仍需与传统形态学方法相结合，以确保监测结果的准确性和全面性。随着技术的进步和相关数据库的完善，eDNA技术在河流无脊椎动物监测中的应用前景依然广阔，但尚需更多的改进和验证。
eDNA在河流无脊椎动物监测中的应用与挑战
研究概览
全球淡水生物多样性正受到污染、栖息地变化和入侵物种等多种压力因素的影响，这些因素导致了一些物种的显著下降（Living Planet Report, 2020）。监测项目在理解自然种群波动及识别导致物种衰退的压力因素方面发挥着重要作用。目前，用于监测与水质状况相关的河流大型无脊椎动物的系统包括英国的河流飞虫监测计划（Riverfly Monitoring Initiative）、英国环境署的英国淡水河流大型无脊椎动物监测计划（BIOSYS）、澳大利亚河流评估系统、欧洲的国家河流水框架指令监测计划（WFD Monitoring Program）。这些项目通常涉及通过踢网采样从河床和水柱中收集样本，并通过肉眼或双筒显微镜对所采集的生物进行识别。然而，这种方法既耗时又成本高昂，且需要专家知识进行物种鉴定。
近年来，eDNA宏基因组技术逐渐应用于河流生态系统的生物监测，被认为在时间和成本上可能更具优势。通过eDNA监测淡水大型无脊椎动物，有望在地理空间上进行更广泛的监测，从而显著增强国家监测计划的能力。这种方法的推广将有助于更全面地了解河流生态系统的状况，为保护这些生态系统提供更为有效的支持。
然而，作为监测河流大型无脊椎动物的手段，DNA宏基因组技术的有效性尚未得到充分验证，同时也存在一些限制其广泛应用的因素。首先，eDNA用于物种鉴定的基础是现有的物种序列信息，而用于标记基因如COI（细胞色素c氧化酶1）、18S（18S rRNA）或16S（16S rRNA）的数据在河流无脊椎动物中相对有限。其次，eDNA样本的分析方法也会影响物种的鉴定能力，例如所使用的引物会影响PCR扩增的效果。另外，环境样本中提取的材料可能会干扰PCR扩增，甚至阻碍引物与DNA的结合。由于eDNA是通过水或沉积物中提取的，因此所检测到的无脊椎动物可能来自上游或曾经存在但现已缺失的生物，这在定义生物来源的准确性上存在一定局限。不同生物的eDNA在不同环境中的降解速率各异，也使得通过eDNA采样一致性地识别特定物种变得更加复杂。
在英国及其他地区，DNA宏基因组技术正在被考虑作为国家河流大型无脊椎动物监测项目中传统方法的补充，甚至可能取而代之。虽然已有多项研究应用了eDNA技术，但关于eDNA与传统方法监测河流无脊椎动物效果的比较却相对较少。虽然Fernández et al.（2018）、Pereira-da-Conceicoa et al.（2021）和Gleason et al.（2021）等研究做出了一定的探索，但这些研究通常限于单一地理位置和/或一两个基因标记及引物组合。因此，单个研究并不能涵盖河流系统的多样性、物种和引物组合，从而无法确定eDNA在监测河流无脊椎动物方面的普遍有效性。
在这项研究中，研究团队对已有文献进行了荟萃分析，以评估eDNA与传统采样方法的有效性，传统方法是通过直接收集完整动物样本并进行形态学分析来检测河流环境中的无脊椎动物。淡水无脊椎动物种类繁多，形态上难以区分，而eDNA方法可能在这种情况下表现出更高的有效性。分析中，研究人员还评估了目前用于监测的DNA标记（如COI、16S和18S）及引物组合的有效性，并探讨这些eDNA标记在识别陆生物种方面的能力，以确定针对河流无脊椎动物的特定分类群所识别的局限性是否同样适用于陆生无脊椎动物。
香江暮色。摄影：裘德卫（Saul Dewei chiu）©绿会融媒·“海洋与湿地”（OceanWetlands）（图文无关）
研究方法
河流与陆地无脊椎动物监测
本研究旨在评估eDNA技术与传统形态学分析方法在河流和陆地无脊椎动物监测中的有效性。研究团队首先进行了系统的文献检索，搜集了2010年~2023年间比较这两种方法的研究数据。通过对比分析，研究团队重点关注不同环境中eDNA技术检测物种的能力，并识别出了eDNA方法在某些门类上的检测空白。
这个研究的首要目标是比较eDNA技术与传统形态学分析在河流无脊椎动物监测中的有效性，并进一步探讨该技术在陆地环境中的应用。为此，研究团队在2023年10月10日通过Web of Science核心合集数据库进行系统性文献检索，关键词覆盖了“分子监测”、“环境DNA”、“形态学评估”等领域，检索时间范围为2010~2023年。这段时间内没有eDNA宏条形码（metabarcoding）的相关数据，因此研究时间限定在该区间。团队还通过Google Scholar进行手动检索，补充了未在Web of Science数据库中收录的相关研究，尤其是《环境DNA期刊》的文献。
从数据筛选与提取方面来讲，在整个文献筛选过程中，研究团队对初步检索出的文章进行了标题、摘要及主文稿的手动筛选，确保其符合研究的标准。筛选的主要标准是：文章必须对比传统形态学方法与eDNA宏条形码技术在宏观无脊椎动物监测中的应用。研究类型限于比较社区层面的监测技术，排除了单一物种检测的研究。对于符合条件的文章，团队进一步提取了两种方法下的分类信息，包括物种/属或科的检测数据。
分类数据被分为三类：1）仅通过eDNA检测到的物种；2）仅通过传统形态学方法检测到的物种；3）两种方法均检测到的物种。此外，研究团队还记录了研究设计的具体细节，如研究地点、栖息地类型以及所使用的DNA标记和引物技术。
接下来就是数据分析了。研究团队利用Python分析软件，对eDNA技术和传统形态学分析检测到的物种数量进行了对比分析，计算了各样本点的物种检测对数比值。对数比值大于0，就表明eDNA检测到的物种更多；反之，则表明传统方法检测到的物种更多。研究人员通过核密度图，直观地展示了各eDNA标记的检测效果，进一步分析了哪种eDNA标记在河流和陆地环境中最为有效。
在河流无脊椎动物的分析中，研究团队重点对比了三种常用的COI引物（mlCOIintF/jgHCO2198、BF2/BR2、fwhF2/EPTDr2n）在物种检测中的表现。通过Shapiro-Wilk测试，研究人员检验了每种引物数据的正态性，并通过Q-Q图确认残差的正态性。随后，研究团队使用单因素方差分析（ANOVA）对不同引物类型的对数比值中位数进行了比较。
研究发现，eDNA方法的检测能力在不同环境和分类群中存在差异。某些河流物种，如水生昆虫类，能够通过eDNA有效检测到，而一些门类如线虫门、软体动物门，则在eDNA检测中常常缺失。此外，通过统计分析，研究团队发现传统的形态学分析在某些群体中的检测能力仍然优于eDNA，特别是那些DNA序列信息有限或DNA降解快的物种。
该研究还表明，不同的引物和标记对检测结果有重要影响。特别是COI引物在河流无脊椎动物的检测中表现出了一定的优势，而其他标记（如16S和18S）则因数据量不足，未能得出稳健的结论。
研究发现
eDNA与形态学评估的对比结论
在这项研究中，研究人员对比了环境DNA（eDNA）技术与传统形态学评估方法在河流和陆地环境中检测无脊椎动物的效果，旨在评估eDNA作为物种监测工具的有效性。研究通过系统检索文献，最终筛选出11项河流研究和5项陆地研究，覆盖全球多个地区。通过233次比较（其中170次为河流环境，63次为陆地环境），分析了eDNA代谢条形码与传统形态学评估之间的差异。
1、研究概述与筛选过程
研究人员最初从约241篇文献中筛选出相关研究。大部分文献主要聚焦于单一物种或非河流环境的微型无脊椎动物，这些研究被排除在分析之外。最终，符合研究标准的16项研究（包括11项河流研究、5项陆地研究）被纳入分析。这些研究涉及全球多个地区（见图1），并比较了不同地点和引物下eDNA技术与传统方法的效果。
2、河流环境中的无脊椎动物检测效果
在河流环境中，eDNA检测到的无脊椎动物种类平均少于传统形态学评估方法的检测结果。无论是COI、16S还是18S等标记，eDNA技术的平均检测数量均低于传统方法（见图3a）。在所有检测的标记中，COI标记表现最佳，其平均对数比高于其他DNA标记，表明它在河流无脊椎动物检测中相对更有效（图2a）。
3、陆地环境中的无脊椎动物检测效果
在陆地环境中，eDNA的表现与河流环境相似，整体检测效果不及传统方法。然而，不同的DNA标记在陆地环境中的检测能力存在显著差异。16S标记在陆地环境中表现最佳，其检测到的无脊椎动物数量与传统评估方法相当，甚至略有优势（图2b）。相比之下，COI标记在陆地环境中的检测效果较差，表现为要么与传统方法相当，要么明显低于传统方法。
4、不同引物的效果对比
研究人员还对不同COI引物在河流环境中检测无脊椎动物的效果进行了比较。结果显示，引物组mlCOIintF/jgHCO2198在检测水生无脊椎动物时表现最优，而LCO1490/HCO2198引物组的检测效果最差（图3）。尽管如此，这些差异未达到统计显著性，表明各引物在检测能力上的差距较小。
5、eDNA与传统方法的物种检测差异
在河流样本中，节肢动物和软体动物是通过传统形态学评估方法检测到的主要类群（图4）。然而，eDNA技术未能检测到其中许多物种，尤其是线虫、扁形动物和刺胞动物等门类，几乎没有物种被eDNA检测到。这表明，eDNA在这些门类的物种检测上存在明显的局限性。
6、仅通过eDNA检测到的物种
尽管eDNA在某些方面表现不足，研究人员发现，有些物种仅通过eDNA代谢条形码技术检测到。这些物种涵盖节肢动物、环节动物、软体动物、刺胞动物等多个门类（图5），并且使用不同标记的eDNA技术（如COI、16S和18S）检测到的物种各不相同。这表明，eDNA在某些物种或类群的检测上具有独特的优势。
通过对比eDNA技术与传统形态学评估方法，这个研究团队揭示了eDNA在无脊椎动物监测中的潜力与不足——在河流和陆地环境中，尽管eDNA技术在某些物种的检测上具有优势，但整体检测效果仍未超越传统方法。未来的研究应致力于优化eDNA标记和引物，以提升其在物种多样性检测方面的能力。
讨论+结论
局限性分析+拓展思考
在该文讨论+结论部分，该研究回顾了这项环境DNA测序在河流无脊椎动物监测中的局限性分析。
通过对现有文献进行的元分析显示，环境DNA（eDNA）测序作为监测河流无脊椎动物群落的手段，未能全面检测出河流中的生物种群，平均检测到的河流物种数量少于传统的形态学方法。eDNA测序在许多情况下未能检测到通过传统形态学评估所发现的大量河流物种，这种情况在陆地无脊椎动物的研究中同样存在。所以说，尽管eDNA作为一种更易于应用的无脊椎动物监测方法具有巨大潜力，但目前所使用的标记（如COI、18S和16S）以及特定的引物（如mlCOIintF/jgHCO2198、BF2/BR2、fwhF2/EPTDr2n）在检测河流物种时仍面临重大局限，尤其是对某些重要门类（如节肢动物、线虫、扁形动物和水螅动物）的检测能力不足。在现阶段，eDNA仍可适用于监测特定的无脊椎动物子集，特别是某些敏感物种，以评估河流质量。但选择适当的监测物种，以及这些物种的基因序列在数据库中的可用性，需考虑监测目的、河流类型等多种因素。
1、eDNA标记在河流无脊椎动物检测中的有效性
分析结果表明，在所有基因标记的评估中，eDNA在检测河流无脊椎动物方面的效果低于传统形态学评估。研究发现，COI标记在检测河流无脊椎动物方面最为有效，这一结果与其他海洋环境中使用该标记的研究一致。这种较高的有效性部分源于COI标记有更全面的无脊椎动物参考数据库。然而，16S标记在检测水螅类时表现出更高的有效性。此外，16S标记在陆地无脊椎动物的检测中比COI标记更为有效，这表明陆地生物的基因信息在数据库中的丰富性可能影响了eDNA的检测能力。
2、PCR引物对河流无脊椎动物检测的影响
用于扩增DNA靶序列的PCR引物和条件对目标物种的检测能力产生了显著影响。在本研究中，针对COI序列的多个引物组合中，mlCOIintF/jgHCO2198引物组对河流无脊椎动物的扩增效果最佳。相比之下，另有研究发现mlCOIintF与HCO2198的组合对某些无脊椎动物的检测效果较差。整体来看，选择合适的引物对检测eDNA至关重要，而不同的环境条件和物种特性也会显著影响检测结果。
3、eDNA测序漏检的河流无脊椎动物
传统形态学评估检测到的大量物种在eDNA测序中未能得到识别，某些门类甚至完全未被检测到。这一现象与可用序列信息的偏差有关，许多门类（如线虫、扁形动物等）的COI序列在数据库中的可用性极为有限。这种信息缺乏导致了特定门类在eDNA检测中的缺失，限制了监测的全面性。
4、eDNA检测到但传统方法漏检的物种
尽管eDNA方法未能检测到传统方法识别的所有物种，但在某些情况下，eDNA检测到了传统方法未能发现的物种。如海绵类物种仅通过eDNA方法被识别，可能是由于传统采样方法未能有效捕获其样本。需要注意的是，eDNA方法可能存在假阳性的风险，这可能是由于沉积物中局部绝灭物种的DNA被重新悬浮至水柱中所致。
在文章最后，作者指出，无论当前可用的DNA标记如何，eDNA测序都无法有效检测到大量河流物种，特别是来自某些门类（如线虫、扁形动物等）。此外，eDNA检测的假阳性问题，也给结果的可靠性带来了不确定性。因此，虽然eDNA测序在水生宏观无脊椎动物监测中具有潜力，但还是得克服上述限制，才能成为一种更为成熟、稳健的生物多样性监测方法。
感兴趣的“海洋与湿地”（OceanWetlands）读者可以参看全文：
Poyntz-Wright I P, Harrison X A, Pedersen S, et al. Effectiveness of eDNA for monitoring riverine macroinvertebrates[J]. Science of The Total Environment, 2024: 173621.
01 元分析
海湿·小百科
元分析 (Meta-Analysis) 是一种统计方法，用于综合和分析来自多个独立研究的数据，以评估某一特定问题或现象的总体趋势或效应。通过对不同研究结果进行定量汇总，元分析可以揭示更广泛的模式和结论，从而提高研究结果的可靠性和普遍性。这种方法常用于医学、生态学和社会科学等领域，帮助研究者克服单一研究样本量小、结果不一致等局限性。
这篇研究使用元分析的主要原因，是为了整合和比较不同研究中关于DNA条形码技术在河流和陆地无脊椎动物监测中的有效性的数据。通过汇总241项相关研究的结果，研究人员能够识别出总体趋势、局限性和差异，从而更全面地评估eDNA技术相对于传统形态学方法的优缺点。
02 标记
海湿·小百科
标记（Markers）是指在生物分子研究中，用于识别和区分不同生物体或其遗传物质的特定DNA序列或基因片段。它们通常用于遗传分析、种群研究和生态监测等领域。在eDNA（环境DNA）研究中，常见的标记包括线粒体基因（如COI、16S和18S），这些基因片段具有较高的变异性和特异性，能够帮助研究人员识别和分类环境样本中的不同物种。有效的标记能够提高检测的准确性和灵敏度，为生态监测和生物多样性研究提供重要支持。在这个研究中，标记（如COI、16S和18S）提供了特定的DNA序列，可以用于区分不同物种、并帮助研究人员评估eDNA与传统形态学方法在物种检测中的有效性；通过比较不同标记的检测能力，研究人员就能够识别出哪些标记在监测特定生态系统中的无脊椎动物时会更为有效。
在上文中，COI（细胞色素氧化酶亚基I，Cytochrome c oxidase subunit I）作为生物多样性研究中常用的分子标记，尤其是在eDNA分析和物种鉴定中，能够帮助科学家有效地识别和区分各种无脊椎动物及其他生物。
03 PCR引物
海湿·小百科
PCR引物（PCR Primers）是短的单链DNA片段，通常由20~30个核苷酸组成，用于在聚合酶链反应（PCR）中特异性地扩增目标DNA序列。引物通过与目标DNA序列的互补结合，标记了扩增的起始点，使DNA聚合酶能够识别并复制这些序列。不同的引物能够针对不同的基因或DNA片段，所以，选择合适的引物，对于成功扩增特定目标至关重要。在生态监测和生物多样性研究中，PCR引物被广泛应用于检测和识别各种生物的遗传信息。
04参考数据库
海湿·小百科
参考数据库（Reference Databases）是存储生物序列信息、注释和相关数据的系统，广泛用于基因组学、转录组学和分子生物学研究。这些数据库包含已知的DNA、RNA和蛋白质序列，科学家可以将其用作比较和鉴定未知样本的基础。例如，在进行物种鉴定时，研究人员可以将实验中获得的序列与参考数据库中的已知序列进行比对，以确定样本的物种或分类位置。常见的参考数据库包括GenBank、EBI和UniProt等。有效的参考数据库对生物研究的准确性和效率至关重要。研究人员可以将实验获得的基因序列与参考数据库中的已知序列进行比对，从而准确识别物种。而且，参考数据库中的序列信息可以用于构建系统发育树，帮助研究物种的进化关系和遗传多样性。
学而思
思考题·举一反三
Q1、在面对现有环境DNA监测技术的局限性时，研究人员如何利用机器学习和生物信息学方法，提升对复杂水域生物群落的检测能力，从而弥补传统方法的不足？
Q2、考虑到不同环境因素对eDNA降解速率的影响，如何建立更精细化的模型来预测特定生态系统中DNA的存留时间，以优化取样策略和监测时间窗口？
Q3、随着全球生物多样性的几句下降，尤其是随着《昆明-蒙特利尔全球生物多样性框架》（GBF）的出台、就得对生物多样性进行有效的监测，那么如何在政策层面推动eDNA技术与传统监测方法的整合，以实现对脆弱生态系统的及时响应、有效保护？
欢迎分享你的想法！（请文末留言）
THE END
海
湿
编译 | 王芊佳
编辑 | Samantha
排版 | 绿叶
【参考资料】
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969724037689
https://www.minipcr.com/what-are-pcr-primers/
https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
https://www.usgs.gov/.../science/resource-managers-edna-toolbox
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