长片段PCR扩增：抑制热交错PCR--STI-PCR的实践与程序复现
文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205221004883#mmc1
经过实践，应用文章提到的特殊5'端引物序列与相应的PCR程序，成功扩增出了10Kb大小的片段，并经过测序验证。PCR酶为KOD Fx Neo。
此外，在PCR的过程中，作者提供的PCR程序并非全都能成功，我在GC含量分布图的基础上直接参考GC含量分布设计扩增时的温度，也全都成功了，所以大家不必拘泥于作者提供的4个模板程序，可以自由发挥。
#引物设计原则：5'端添加通用序列，5′-gcctggctccacgctccgagt-3′ with Tm = 68°C,
#5′-gcctggctccacgctccgagtg-3′ with Tm = 69.6°C,
#and 5′-gcctggctccacgctccgagtgg-3′ with Tm = 71.3°C ，
#较高的Tm值保证了itr在68°C - 72°C退火和延伸过程中的稳定配对。
#然后添加3'特异序列，Tm在62~64℃
#PCR体系中引物浓度为0.1~0.15μM为佳
#KOD FX Neo酶用量：小于20Kb时，1 U/100Ul，可选择40μL体系0.4U
#1%的胶为好
#40μL体系中DNA为40ng左右。由于我担心DNA质量不好，所以用的是60-70ng，也成功了。
关于文章提到的判断应该应用何种PCR程序的函数，我借助ChatGPT用R语言成功进行了较大程度的复现，程序如下：
比如下面这个序列的图：
网站和我的程序推荐的结果是一样的，程序IV，TIC 13,，但是没有扩出来。
我看着这图的GC含量分布琢磨，就着KOD Fx Neo的扩增速度30s 1 Kb，就设计这么一个程序（实验记录本不在手边，随便编一下，展示一下思路，反正实验成功的程序当时也是这么随便编就成功了）：
s1: 94℃ 2min
s2: 98℃ 10s
s3: 62℃ 1 min #扩增到2Kb处
s4: 60℃ 5s
s5: 62℃ 5s
s6: 64℃ 5s
s7: 66℃ 5s
s8: 68℃ 5s
s9: 70℃ 5s #跳转到s4，循环7次。扩增到8Kb处，6Kb的话6次循环3min就够了，但留点余量，7次。
s10 60℃ 5s
s11 62℃ 5s #跳转到s10,5次循环
s12 68℃ 5s
s13 70℃ 5s
s14 68℃ 5s #到这里应该扩完了
s15 68℃ 20s #防止后面循环中酶的效率下降，留出的余量。跳转到s2，35个大循环。
s16 68℃ 2min#结束
和文章程序一样，使用了嵌套循环，对于更简单一些的序列，不用嵌套循环也可成功。
对于10k左右的扩增，大概需要7个多小时左右。此外，有的PCR仪不支持这种大的PCR程序，注意避开。