同基因脊髓肌萎缩症（SMA）类器官模型揭示神经发育早期缺陷机制
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社
文章介绍
2024年8月20日，德国神经退行性疾病研究中心Tobias Grass以第一作者兼通讯作者身份在Cell Reports Medicine（IF：11.7）杂志发表最新研究成果：Isogenic patient-derived organoids reveal early neurodevelopmental defects in spinal muscular atrophy initiation，表明脊髓肌萎缩症（SMA）患者来源的类器官显示出早期神经发育缺陷，特别是在运动神经元的加速分化和关键发育障碍方面，这些变化发生在与SMA相关的特征性神经元丧失之前。
#1
研究背景
Background
脊髓肌萎缩症（SMA）作为一种常见的遗传性神经肌肉疾病，其主要特征是脊髓运动神经元的退化，导致肌肉萎缩和严重的运动功能障碍。SMA是由SMN1基因的突变或缺失引起的，SMN1基因编码生存运动神经元（SMN）蛋白，而人类还拥有一个部分补偿SMN1缺失的SMN2基因。尽管已有研究表明，SMN蛋白在神经元发育和存活中至关重要，但对SMA的发病机制仍缺乏深入的理解，尤其是在发育早期阶段。
近年来，越来越多的证据表明，神经退行性疾病可能具有发育成分，这意味着在神经元分化和成熟过程中可能会出现早期的病理变化，这些变化可能在疾病症状出现之前就已经存在。因此，研究者们开始关注SMA的早期发育阶段，试图揭示在这一阶段发生的细胞和分子机制。
#2
研究思路
Methods
本项研究的开展主要包括以下几个步骤：
1、建立同源脊髓肌萎缩症（SMA）诱导多能干细胞（hiPSC）模型：研究者们首先生成了一系列同源的SMA hiPSC细胞系，这些细胞系来源于SMA患者，以确保研究的相关性和准确性。
2、诱导脊髓类器官（SCOs）：利用这些hiPSC细胞，研究团队开发了脊髓类器官模型。这些类器官模拟了脊髓的发育过程，使研究者能够在体外观察SMA的发育缺陷。
3、单细胞转录组分析：研究者们进行了纵向的单细胞转录组分析，以评估不同发育阶段细胞的基因表达情况。这种分析帮助识别出SMA类器官与健康对照类器官之间的差异，特别是在神经前体细胞（NMPs）的特化和分化方面。
4、细胞群体分布和组织学分析：通过细胞群体分布的定量分析和组织学检查，研究者们观察到SMA类器官中神经细胞和肌肉细胞的比例失衡，进一步确认了NMPs在SMA发育中的早期耗竭和向中胚层谱系的偏向。
5、比较分析：研究者们将SMA类器官的结果与健康对照组和其他轻型SMA形式进行比较，以评估不同类型SMA的发育特征和病理变化。
6、探讨分子机制：研究团队还探讨了SMN蛋白在神经元发育和存活中的分子功能，试图揭示其在SMA发病机制中的作用。
#3
关键研究结果
Results
从不同严重程度的 SMA hiPSC 系生成同源对照 hiPSC
在这项研究中，研究人员生成了来自不同严重程度脊髓性肌萎缩症（SMA）患者的同源性诱导多能干细胞（hiPSCs）克隆（图1）。大多数SMA患者的SMN1等位基因被删除或严重突变，因此针对SMN1的基因编辑方法通常不可行。研究团队使用了三种已知的SMA hiPSC细胞系，并通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，针对SMN2基因生成了三组同源性hiPSC克隆。每个SMA母细胞系生成了两个独立的同源性克隆，修正了SMN2基因第7外显子的C到T的核苷酸变化。
研究中使用了两种供体DNA片段：一种与第6内含子-第7外显子同源，另一种与第7外显子下游区域同源，包含报告基因Clover。通过PCR和Sanger测序确认了编辑的正确性，并且在SMA母细胞系中未检测到SMN1等位基因，确认了SMN2的存在。最终，选择了每个细胞系的两个克隆进行后续研究，所有克隆在染色体结构上正常，并表达正常的多能性标记物（补充图1）。
研究结果表明，修正后的克隆中SMN蛋白水平显著提高，且该模型为探讨SMA的早期发育阶段提供了基础，强调了在不同遗传背景下比较疾病与健康细胞系的局限性。这一同源性模型的建立有助于更好地理解SMA的发病机制及其早期发育缺陷的因果关系。
图 1 从不同严重程度的 SMA hiPSC 系中生成同基因对照 hiPSC
补充图 1. 从不同严重程度的 SMA 人类 iPSC 系生成同源对照 hiPSC，与图 1 相关。
C端Clover报告基因不影响SMN蛋白的主要特性
该研究探讨了C-末端Clover报告标签对SMN蛋白的影响，SMN蛋白在snRNP的生物合成中至关重要，并且在与Cajal小体相关的细胞质和核内小体（gems）中定位。研究人员将BJ母细胞系和SMN编辑的hiPSC系分化为脊髓运动神经元（MNs），并进行了多种实验以评估Clover标签是否影响SMN的特性。
主要发现包括：
gems的招募和形成：Clover标签的存在并未改变SMN在核小体中的招募或其形成，最初观察到SMN+gems数量没有显著变化。然而，在8天后，观察到Clover+gems数量显著增加，这可能是由于标记蛋白的荧光强度更高。
蛋白聚集和动态：在hiPSCs或衍生的MNs中未检测到SMN蛋白聚集。使用MLN4924处理增加了Clover+gems的数量，而使用环己酰亚胺（CHX）处理则减少了gems数量，表明Clover标签不影响gems的动态。
结合和周转：共免疫沉淀研究表明，SMN:Clover与未标记的SMN和Gemin2结合，而不干扰SMN的自聚合或与其他复合物成分的结合。SMN:Clover的半衰期约为40小时，类似于未标记的SMN，表明该标签并未显著改变SMN的周转（补充图2）。
蛋白水平和功能：在修正的hiPSCs中，SMN蛋白水平比母细胞系高出3到4倍，Clover标签未影响Gemin2水平。此外，研究还测量了与SMN依赖性剪接相关的snRNA水平，发现SMA I型MNs中次要snRNP的水平显著降低，而在同源对照中得到了纠正（补充图3）。
总之，结果表明SMN:Clover融合蛋白保留了未标记SMN的基本特性和功能，使其成为进一步研究SMN生物学及其在脊髓性肌萎缩症（SMA）中作用的合适工具。
补充图 2. 标记 SMN C 端的 Clover 报告基因不会改变蛋白质的生物学特性，与图 1 相关。
补充图 3. 次要和主要剪接体 snRNA 在三种健康对照 iPSC 系中显示出相似的表达水平，与图 1 相关。
矫正后的同基因 hiPSC 系与健康对照和 SMA 亲本系表现出相似的增殖率和分化潜力
多项研究报告了脊髓性肌萎缩症（SMA）模型中细胞周期基因的变化，但关于SMN缺失对细胞增殖的影响结果存在矛盾，具体取决于细胞类型和SMN减少的程度。研究者调查了同源性修正的SMA细胞系，这些细胞系的SMN蛋白水平显著高于亲本细胞系，是否表现出不同的生长特征，从而影响其分化能力。
在实验中，BJ对照组和三种SMA同源性细胞系的hiPSC克隆被分离并培养。使用细胞穿透性荧光探针SiR-DNA标记活细胞DNA，并在不同时间点对细胞进行成像。结果显示，SMA细胞系与BJ对照组之间的细胞群体生长速率没有显著差异，尽管I型细胞系表现出更高的脆弱性，初始附着到培养板上的细胞数量较少。此外，修正克隆与其同源性SMA亲本之间也未观察到显著差异。
在分化能力的评估中，研究者验证了不同谱系特异性标记基因的表达水平，结果显示在特定培养基中，hiPSC的分化潜力没有表现出一致的偏向。总体而言，这些结果表明，同源性修正的hiPSC在增殖和三种胚层分化潜力上与亲本细胞系没有显著差异，支持了SMN对细胞周期进程和细胞增殖的调控具有细胞类型特异性（补充图4、5）。
补充图 4。矫正后的同基因 SMA hiPSC 增殖并分化为三胚层，与 SMA 亲本系和健康对照类似，与图 1 相关。
补充图 5. 矫正后的同源 SMA hiPSC 分化为三胚层，类似于 SMA 亲本和健康对照 hiPSC 系，与图 1 相关。
在矫正的同基因系中，有丝分裂后 SMA MN 的进行性死亡得以挽救
为了更准确地模拟脊髓性肌萎缩症（SMA）病理过程并研究运动神经元（MNs）的死亡机制，本研究采用了同源SMA模型，对控制线及三组同源三重体进行了基于胚体的MNs分化实验。通过SiR-DNA染色和成像技术，在培养后不同时间点对MNs进行量化分析，结果显示，在更严重的SMA表型（如51N-II和38D-I）中，MNs的存活率显著降低，仅为健康对照的70%左右，而表型较轻的39C-III SMA MNs存活率则无显著下降。这一发现提示了SMA表型严重程度与MNs存活率之间的直接关联，以及在更严重表型中可能存在的更大治疗潜力。
重要的是，与BJ WT相比，修正后的SMA MNs显示出完全的存活救助，证明了编辑后的SMN蛋白的功能性。通过对类型I同源三重体的脊髓球体进行固定和免疫染色，确认SiR-DNA活细胞成像的细胞为神经元，超过95%的细胞为MAP2+神经元，约60%表达ISL1。结果表明，转化SMN2为SMN1显著增加了SMN蛋白，从而改善了后分裂MNs的死亡。尽管SMN缺乏是MNs死亡的主要因素，但其他因素也可能起作用。因此，同源模型提供了一种比使用健康供体的hiPSC线更好的方法，以生成与疾病相关的知识。
补充图 6. 与亲本 SMA I 型系相比，同基因矫正克隆中的 MN 存活率增加，且 ISL1+ 和 MAP2+ 细胞百分比相似，与图 2 相关。
图 2. SMA hiPSC 衍生的脊髓 MN 死亡在同源矫正系中得到挽救
SMA hiPSC 显示 SCO 形成受损，矫正后的同基因系部分恢复了该表型
该研究表明，等位基因模型有效地复制了SMA的关键特征，特别是与疾病严重程度相关的MNs死亡。研究人员专注于理解SMN蛋白在运动神经元存活中的重要作用。他们改进了EB基础的分化方案，通过控制hiPSCs的初始数量，创建了一个更稳健的模型，使得在细胞外基质中形成单个干细胞聚集体成为可能。
使用腹侧脊髓类器官（vSCO）方案（图3），他们研究了运动神经元的特征化、成熟和存活，并将等位基因SMA细胞系与健康对照进行比较。通过测量vSCO的形成效率和生长情况，作为类器官健康的指标。结果显示，尽管野生型（WT）hiPSCs有效地形成聚集体，但严重的SMA细胞系38D-I在初始阶段仅有40%形成聚集体，到实验结束时提高到70%。相比之下，较轻的SMA细胞系39C-III表现出更好的自组装能力，最终达到100%的形成率（补充图7）。
经过修正的等位基因细胞系部分恢复了自组装能力，表明SMA hiPSCs的缺陷并非由于增殖的一般失败，而是由于在早期胚胎发育中自组装和存活的能力受损。研究总结认为，特别是I型SMA hiPSCs在早期胚胎发育中存在显著缺陷，这对正常形态发生至关重要，因为当两个SMN1等位基因突变或缺失时，细胞间粘附力的作用变得尤为重要。
图 3 SMA hiPSC 在接受脊髓类器官方案时呈现出有缺陷的球体形成和生长，这在同基因矫正系中得到了改善
补充图 7. SMA hiPSC 自组装成球体的效率低于同基因矫正克隆或健康对照线，与图 3 相关。
SMA vSCO 显示神经发育改变，这在等基因对照系中得到部分矫正
研究发现，尽管关于SMA运动轴突缺陷存在争议，但最近的研究表明，MN前体细胞存在异常，导致MN迁移、靶向神经支配和存活问题。通过比较健康对照和SMA线以及同源修正克隆（补充图8），研究发现SMA类型I线的神经干细胞标记物SOX2和NESTIN水平显著降低，表明SMN缺乏可能改变特定的神经干细胞亚群。此外，SMA vSCOs中全神经元和MN特异性基因的表达发生了变化，某些标记物的表达时间线也异常，显示出疾病vSCOs中神经发生的加速（图4、补充图9）。虽然同源修正克隆在某些表型上部分恢复了功能，但一些病理特征仍然存在，表明产后SMN恢复可能无法完全纠正发育异常。这些发现强调了使用同源模型理解SMA特定发育改变的重要性。
图 4 SMA 脊髓类器官显示出神经发育改变的迹象，这种表型在同基因对照中得到了部分纠正
补充图 8. 与同基因对照和健康对照相比，在轻度 SMA vSCO 中没有观察到主要的早期神经发生缺陷，与图 4 相关。
补充图 9. SMA vSCO 中的神经规范程序缺陷和 MN 分化加速，与图 4 相关。
纵向 scRNA 测序揭示了 SMA 神经肌肉 SCO 中存在中胚层特化偏向，而神经谱系则受到损害
研究人员通过诱导神经肌肉中胚层前体细胞（NMPs）开发了一个更复杂的脊髓类器官（SCO）模型，以探讨其在胚胎发育中对神经和中胚层谱系形成的重要性。主要发现包括（图5-6、补充图10）：
细胞复杂性：在不同发育阶段（第4天、第20天和第40天）的SCO中，使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）识别出不同的细胞群体及其谱系承诺；
谱系偏向：在SMA I型SCO中，观察到向中胚层谱系的显著偏向，而神经外胚层和神经嵴细胞的比例减少，这种偏向在同源克隆中部分得到了纠正；
基因表达：SMA SCO中神经干细胞标记物（SOX2、NESTIN）的表达减少，肌肉前体细胞标记物的表达升高，提示细胞身份发生转变；
发育异常：到第40天，SMA SCO中运动神经元（MNs）的数量减少，而肌肉细胞比例增加，突显出神经肌肉接头形成和维持的缺陷；
WNT信号通路：研究发现SMA SCO中WNT信号通路失调，可能导致神经肌肉谱系错误特异性。
总体而言，研究强调了SMA早期发育的改变，表明SMN在神经谱系特异性中发挥着关键作用，且产后恢复SMN可能无法完全纠正与该疾病相关的病理表型，为进一步研究SMA的分子机制和潜在治疗策略提供了基础。
图 5. 纵向单细胞转录组分析揭示了 SMA I 型 SCO 中的 NMP 错误指定有利于中胚层谱系承诺
图 6. 早期 SCO 中的 SMA NMP 中胚层偏向导致成熟类器官中 MN/神经细胞簇数量减少，肌肉细胞增多
补充图 10.第 4 天、第 20 天和第 40 天 SCO 的单细胞 RNAseq 细胞簇识别，与图 5 和图 6 相关。
在 SMA SCO 中观察到的早期神经中胚层命运决定缺陷在体内重现
团队研究了在体外同源模型中观察到的神经中胚层特异性缺陷是否在体内得到了重现。在小鼠胚胎的轴向延伸过程中，神经中胚层前体(NMPs)位于尾芽区域，参与形成延伸的神经管、前体中胚层和尾芽中胚层。研究人员使用了E10.5 SMND7胚胎，这是最常见的SMA小鼠模型，并与杂合子对照进行比较，以研究早期脊髓形成。
结果显示，SMA E10.5胚胎的神经管面积显著减少了16%，与健康杂合子相比，周围的中胚层组织面积则相应增加，导致神经与中胚层的比例降低。这些发现与神经肌肉类器官中的体外结果一致，再次表明NMP的错误特异化。此外，研究人员还量化了胚胎尾芽中NMP的丰度，发现SMA胚胎中的NMP数量显著减少。这些结果表明，SMA胚胎中的NMP池可能会更早耗竭，并且SMA NMP显示出对中胚层谱系的优先承诺。
图 7 SMNΔ7 小鼠胚胎的早期神经中胚层命运定型缺陷
总结
本研究采用了同源患者来源的脊髓类器官模型，以便在体外模拟SMA的发育过程。通过对这些类器官进行单细胞基因表达分析和细胞群体分布研究，研究者们能够观察到SMA类型I的神经中胚层前体细胞在早期发育阶段表现出向中胚层特化的偏好，而对神经命运的回避。这种偏向性导致了肌肉细胞谱系的偏倚，进而影响了运动神经元的生成和发育。然而，该模型虽具突破性，其局限如细胞系差异及体外模拟不足，限制了结果的广泛性和真实性，提示未来研究需克服这些障碍，以深化对SMA发病机理的认识。
参考信息：
Grass T, Dokuzluoglu Z, Buchner F, et al. Isogenic patient-derived organoids reveal early neurodevelopmental defects in spinal muscular atrophy initiation. Cell Rep Med. 2024;5(8):101659. doi:10.1016/j.xcrm.2024.101659
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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社