新突破！转录组+代谢组揭示机械胁迫调控油菜胚胎发育及成熟机制

胚在种子内最初的自由扩张在某种程度上被与它接触的种皮所抑制，导致其形成褶皱和边界。但机械力似乎触发并加速了种子的成熟。然而，这种效应的机制基础仍不清楚。近日，德国莱布尼茨植物遗传与作物植物研究所Ljudmilla Borisjuk课题组在New Phytologist上发表题为“Mechanical forces orchestrate the metabolism of the developing oilseed rape embryo”的研究论文。研究者油菜体内体外空间限制后，进行磁共振成像和计算机图形重建、免疫标记、流式细胞术、转录组学、蛋白质组学、脂质组学和代谢组学分析，揭示了机械力如何调控油菜胚胎发育并启动其成熟过程的证据。

1.空间限制影响胚胎发生过程

发育10天的荚果上缠绕管子阻碍种子发育的扩张空间（图1a，b）。研究发现，处理过的荚果中形成的胚胎比对照胚胎更早开始变形，并且变形进展更快（图1c）。处理组荚果中发育的胚胎完全占据了可用空间时，非处理组荚果种子子叶仍在扩张。表明胚乳对空间限制的响应比胚胎早得多（图1e），并且胚乳在空间受限的种子中更早停止扩张。总体结论是，减少胚胎扩张的空间会诱导其过早变形。

 图1 空间限制对甘蓝型油菜胚胎发生的影响

2.空间限制减少了胚胎中的细胞增殖

流式细胞术测定了机械压力后15、20和25天种子胚的细胞数量。15-25的时间跨度从细胞快速增殖期结束一直延伸到细胞扩增期。在机械压力15天时，处理胚胎和对照胚胎的细胞数量相似(图2a)，到20天时，处理组细胞数量增加了一倍，对照组细胞数量增加了两倍(图2b)。这表明，限制胚胎的生长会损害细胞的增殖。

图2 空间限制条件下甘蓝型油菜胚细胞增殖、基因表达及ABA含量

3.空间限制胚胎的转录组及代谢组分析

对机械压力处理10和15天的处理组及对照组进行转录组检测。10天两组样本差异基因仅有3个，15天后增加至76个。GO富集分析显示，机械限制导致处理组“细胞对缺氧的响应”下调，而“硫酸盐同化”上调。受压胚胎中与压力相关的蛋白和细胞增殖相关的基因表达下调，而与硫代葡萄糖苷合成相关的基因表达上调。机械压力增加了胚胎对硫的需求，这与储存蛋白和硫代葡萄糖苷的合成有关。受压胚胎中与细胞周期控制、氧化应激防御和ABA（脱落酸）信号传导相关的基因表达上调。通过LC-MS分析发现，受压胚胎中的ABA水平更高，与此一致的是，与ABA信号传导相关的转录因子的表达也上调。尽管施加了机械压力，但某些已知的机械感知相关基因的转录没有受到影响。数据表明对胚胎施加机械约束的效果是抑制细胞周期活性，同时促进储存产物的合成/积累、ROS防御机制和ABA相关信号传导。

对压力处理5、10、15、20、25和30样本进行靶向和非靶代谢组检测，检出152种代谢物。处理影响了糖酵解途径（图3）。处理组15/20d胚胎中，果糖-1,6-二磷酸及其两个裂解产物二羟丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸的水平都显著更高。处理组15d后，三酰甘油（TAG）合成前体甘油-3-磷酸（G3P）表达水平提高了九倍。机械限制15d后的胚胎进行脂质组检测，鉴定出170种脂质。压力胁迫处理TAG含量比未受压胚胎高17-38%。油酸（C18:1）和二十碳烯酸（C20:1）的含量增加，同时高饱和脂肪酸的比例降低。空间限制促进了储存脂质的沉积开始，但对其他脂质类别没有影响。

图3 空间限制条件下甘蓝型油菜胚胎体内生长的代谢组变化

4.空间限制胚胎的蛋白质组检测

对机械限制处理10，15天的种子分别进行蛋白质组检测。10d，处理组与对照组有61种蛋白存在差异；15d时，有25种差异。空间限制处理促进了蛋白质储存沉积，特别是某些特定蛋白质（如RmlC-like cupins、种子储存白蛋白4和十字花蛋白1）的含量显著增加。处理还影响了参与氨基酸合成、脂质合成/储存、糖类代谢、ROS代谢和糖酵解的酶的蛋白质含量。胚胎特异性、与质膜相关的TRAF样家族蛋白的积累受到抑制。一些差异积累的蛋白质也在珠被或胚乳中表达，它们的差异丰度可能与机械压力诱导的珠被和/或胚乳生长过早停止有关。

图4 空间限制甘蓝型油菜种子蛋白质组的变化

5.空间限制对体外培养胚胎生长的影响

在子叶阶段切除胚胎，并在不同体积特制球形培养室内培养，来研究种子对空间限制的响应。空间限制可以增加胚胎生物量和合成主要储存产物的能力。生长空间越小，胚胎就越小，其脂质和蛋白质含量就越高。在空间制条件下生长的胚胎比未受阻碍生长的胚胎更早且更多地积累脂质。

图5 空间限制对甘蓝型油菜胚离体培养生长成熟的影响

6.空间限制体外培养胚胎转录组及代谢组分析

对3.5mm和5mm限制空间的培养室培养的胚胎进行转录组测序。研究结果发现，与对照组相比，3.5mm有316个差异基因，5mm有446个。两组差异表达的基因中有178个基因是共同的，这表明空间限制对胚胎基因表达有显著影响。GO富集分析发现，在机械限制下，光合作用显著下调。与细胞增殖、细胞板形成、胚胎极性和模式建立相关的基因的下调，以及与细胞分裂和分化调节相关的基因的下调，如BAM1和SERK1。流式细胞仪测量结果表明，机械应力的严重程度与胚胎细胞数量呈负相关，即空间限制导致细胞数量减少。与储存化合物代谢促进相关的基因表达上调，如编码寡肽转运体、谷氨酸脱氢酶、谷胱甘肽S-转移酶和LEA蛋白的基因。淀粉合成的发育关闭，表现为颗粒结合淀粉合成酶基因表达的下降。热休克蛋白（HSPs）基因的上调表明胚胎早熟，这是晚期种子成熟的标志。与水分调节相关的基因，如编码水通道活性相关蛋白的PIP3A和PIP3C，以及TPS1（海藻糖-6-磷酸合成酶）基因的表达被抑制，这与成熟种子的脱水特征一致。

空间限制处理的代谢组检测发现，空间限制促进了能量丰富的核苷酸三磷酸和辅因子的积累，如维生素B6磷酸盐、黄素单核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和有机酸（三羧酸循环的中间体）。空间限制导致短链脂肪酸、谷胱甘肽及其前体以及某些酚酸（包括苯甲酸，作为叶酸生物合成的前体）的积累，这些物质与多种细胞功能相关。空间限制的胚胎中，两个糖酵解中间体果糖-1,6-二磷酸和二羟丙酮磷酸的水平得到提升，表明糖酵解途径受到影响。空间限制几乎耗尽了所有游离氨基酸（除了天冬酰胺）和多胺（如瓜氨酸）、三甲胺、乳酸和抗坏血酸，这些都是细胞代谢的关键成分。空间限制导致乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸的水平显著升高。总体上，逐渐增加的机械限制在碳/氮（C/N）代谢上引起了特定变化，尤其是在核苷酸、辅因子和氧化还原代谢方面。这些发现表明，空间限制对胚胎的代谢途径有显著影响，特别是在能量代谢和储存化合物的合成上。

图6 代谢途径图显示了体外培养的甘蓝型油菜胚胎代谢产物丰度的变化

本文对影响油菜胚胎体内或体外生长的机械约束的操作与分析方法相结合，包括磁共振成像和计算机图形重建、免疫标记、流式细胞术、转录组学、蛋白质组学、脂质组学和代谢组学分析。数据表明，在体内，施加机械约束阻碍了种皮和胚乳的扩张，导致胚胎变形。胚胎发育的加速意味着细胞增殖的停止和脂肪和蛋白质储存的刺激，这是胚胎成熟的特征。潜在的分子特征包括细胞周期控制、活性氧代谢和转录重编程，以及糖酵解通量的变构控制。缩小体外生长的胚胎的生长空间也引起了类似的反应。结论是，对发育中的油菜胚胎的生长施加机械约束是其成熟的重要触发因素。