验证蛋白质与DNA互作，染色质免疫共沉淀(ChIP)实验全流程

作者：科研根号三发布时间：2024-09-13

宝子们，生科人实验互帮互助微信群建好了！WB、流式细胞术、PCR、免疫组化/荧光、Elisa...

染色质免疫共沉淀基本原理是在活细胞状态下，固定蛋白质-DNA（染色质）复合物，并将其切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法（抗体亲和）沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片段的纯化与后期检测，从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。

一、ChIP实验原理

染色质免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation，ChIP）技术是目前公认的研究蛋白质与DNA 相互作用的最佳选择。

基本原理是在活细胞状态下获得自然状态下蛋白质、DNA结合复合物，通过试剂交联固定蛋白DNA复合物，破碎细胞后获得细胞核DNA片段，利用超声波方法将核DNA随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法磁珠吸附沉淀染色质片段，特异性的富集蛋白结合的DNA片段，通过系列方法洗脱得到DNA片段并纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP实验应用

·ChIP 可以检测体内多种转录因子与DNA 的动态作用；

·研究组蛋白的各种共价修饰（如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等）与不同状态下基因表达的关系。

·ChIP 与高通量测序技术相结合建立的ChIP-seq 方法已广泛用于特定转录因子靶基因的高通量分析和鉴定；

·ChIP 与体内足迹法相结合，用于寻找转录因子的体内结合位点；

·RNA-ChIP 用于研究 RNA 与蛋白的相互作用以及 RNA 在基因表达调控中的作用。

二、 ChIP实验流程

ChIP 的一般流程是：甲醛固定细胞---收集细胞，将染色质复合物中 DNA 切割---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合---加入Protein A 或 Protein G 微珠，结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物---解交联，纯化富集的DNA 片段---PCR 或测序分析。

1、细胞的甲醛交联与裂解

①新鲜组织或活细胞中加入终浓度为1%甲醛，37℃/10min将染色质上的DNA和目的蛋白交联起来，稳定蛋白与DNA的天然结合状态以免后续的实验步骤破坏这种相互作用。

甲醛可以非常容易的穿过细胞膜及核膜进入细胞核，能介导蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA的共价交联，并且这种交联是可逆的。甲醛交联的机制是DNA碱基上的氨基与亚氨基和蛋白质上的赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基均可以和甲醛发生缩合反应，分别形成共价键，最终形成甲醛连接的DNA/RNA/protein复合体。甲醛的交联是可逆反应，可以通过加热的方式解除交联，从而方便后续的DNA分析。

②加入终浓度为0.125M的甘氨酸，室温反应5min，淬灭未反应的甲醛，终止交联。原理是甘氨酸的氨基与甲醛反应以消耗掉多余甲醛。

③弃培养基，用预冷的1×PBS洗涤细胞，细胞刮刀收集细胞后离心收集细胞。去除上清液细胞重悬于0.5mL含蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液中，冰上孵育15min。

④离心去上清，0.5mL含蛋白酶抑制剂混合物的细胞核裂解缓冲液重悬充分裂解。

蛋白酶抑制剂混合物：蛋白酶抑制剂指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。包括Aprotinin、Bestatin、E-64、Leupeptin和Pepstatin等，这些物质对半胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和氨基肽酶具有广谱特异的抑制性。

细胞裂解缓冲液：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS

2、染色质片段化

将染色质打断成200-500bp的小片段，在后续实验中，结合了目的蛋白的片段将被抗体识别而保留，没有结合目的蛋白的小片段则将被洗脱。超声法或酶消化法都可。

微球菌核酸酶(MNase)，是一种来源于金黄色葡萄球菌的核酸内切酶，在pH7.0-10.0和Ca2+的条件下可降解单链、双链、线状、环状等多种形式的DNA或RNA，并产生3'磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸。MNase对单链核酸的切割效率比双链核酸更高。

MNase在腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)的5'侧的切割效率是鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的约30倍，能较好地酶解富含AT或AU区域，所以MNase是“相对”非特异性的核酸内切酶，常用于去除细胞裂解液中的核酸等。另外，MNase仅切割染色质上未结合蛋白质的DNA区域，不消化与组蛋白或其他染色质结合蛋白（例如转录因子）结合的DNA，因此MNase也常被应用于染色质免疫沉淀实验中的染色质片段化。

3、靶蛋白和DNA的免疫共沉淀

通过目的蛋白的特异抗体，对“DNA-目的蛋白”复合物进行富集与洗脱。通过使用特异性抗体和可结合抗体的介质(如Protein A/G Agarose或Protein A/G磁珠)，或直接使用偶联特异性抗体的介质(如琼脂糖凝胶或磁珠)，然后通过离心或磁力从溶液中分离出抗原和抗体复合物，从而将目标蛋白质从复杂样品中分离出来。

Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，Protein G是C型或G型链球菌表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似，能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白 (Ig)结合。同时，两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。

Protein A/G Agarose：琼脂糖珠海绵状的结构(直径50-150μm)可以结合抗体(继而结合靶蛋白)，它能够直接高效、快速结合抗体，而不需借助特殊的专业设备。此外，琼脂糖树脂是多孔的，这使得它们拥有更大的表面积可与蛋白质相互接触，具有更高的结合载量。在纯化大量蛋白的时候，传统的琼脂糖偶联抗体是IP实验的完美选择。

Protein A/G磁珠：磁珠表面通过外部修饰的功能基团结合活性蛋白，作为抗原抗体反应的载体。复合物具有强磁响应性，在磁力的作用下定向移动，使复合物与液体中其他物质分离，达到分离、浓缩、纯化特异性蛋白的目的。

4、洗脱和解交联

使用去垢剂和热来洗脱蛋白 A/G 珠子上的染色质；通过高热和高盐解开交联。此外，还添加蛋白酶K来消化有关的染色质蛋白和添加的抗体，以便更高效地进行下游 DNA 纯化。

抗原抗体的结合反应：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。抗原抗体间结合为非共价键结合：静电引力、范德华力、氢键结合力、疏水作用力。

①静电引力是因抗原、抗体带有相反电荷的氨基与羧基基团间相互吸引的能力。

②范德华引力是原子与原子、分子与分子相互接近时分子极化作用发生的一种吸引力，是抗原、抗体两个大分子外层轨道上电子相互作用时，两者电子云中的偶极摆动而产生的引力。

③氢键结合力是供氢体上的氢原子与受氢体上氢原子间的引力。

④疏水作用力：水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。当抗原表位和抗体超变区靠近时，相互间正负极性消失，周围亲水层也立即失去，从而排斥两者间的水分子，使抗原抗体进一步吸引和结合。疏水作用力是这些结合力中最强的，因而对维系抗原抗体结合作用最大。

蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，这些残基在溶液中带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云。如果溶液pH偏高，蛋白质分子带负电荷，周围出现极化的水分子，形成水化层，而当抗原抗体的结合，使表面电荷减少或消失，电子云也消失，水化层变薄，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。此时如再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。

抗原抗体反应环境条件：

①抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点，抗原抗体反应一般在pH6～9进行，pH过高或过低都将影响抗原与抗体反应。

②在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速，一般为15℃～40℃。常用的抗原抗体反应温度为37℃，温度如高于56℃可导致已结合的抗原抗体再解离、甚至变性或破坏。

③抗原与抗体发生特异性结合后，由亲水胶体变为疏水胶体，常用0.85%NaCl或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。此外，适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触,加速反应。

洗脱：抗体洗脱液的原理是利用强酸（pH值2.8）或高盐（近中性）环境下，破坏结合力等因素，使得抗原抗体复合物变成抗原抗体单体。

5、DNA纯化

去除染色质交联之后，使用典型的酚-氯仿及随后的乙醇沉淀方法或使用 DNA纯化柱试剂盒来进行DNA纯化。一旦完成了 DNA 纯化，便可进行多种下游分析，包括ChIP-qPCR、ChIP-芯片和ChIP-seq。

三、ChIP实验重点实验细节

1、交联

内源状态下，蛋白和DNA的结合多数是动态的，交联能实现捕获特定时间内蛋白和DNA结合的情况。交联剂的选择和使用方法很重要！

①甲醛：甲醛是最常用的交联剂，是零长度交联剂，是两种直接相互作用的分子的理想选择。

②较长交联剂：对于更复杂的相互作用，较长的交联剂如EGS（乙二醇双（丁二酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯））或DSG（二琥珀酰亚胺基戊二酸酯）可捕获具有复杂四级结构的更大蛋白质复合物。

③天然交联：对于一些组蛋白，可以使用天然ChIP，因为蛋白质-DNA相互作用（例如，H3-DNA和H4-DNA）本身就使二者紧密结合，从而不需要交联。

交联技巧

·确定你要观察的相互作用的类型，以确定要使用的交联剂。

·交联剂一定要新鲜。

·交联步骤的持续时间很重要。时间过短会导致交联效率低下，过长会导致难以使染色质裂解，且难以将其剪切至可用的长度。

2、细胞裂解

由于蛋白质-DNA相互作用主要发生在细胞核内，因此去除胞浆蛋白可以帮助减少背景信号并提高灵敏度。蛋白酶和磷酸酶抑制剂在此阶段对于维持完整的蛋白质-DNA复合物至关重要。传统机械裂解可能会导致效率较低，建议用核质分离试剂盒以消除背景信号。

细胞裂解技巧

·可以在显微镜下观察到细胞裂解是否成功。在裂解前后取10μL的样品，并使用细胞计数器检查所有细胞与细胞核。

·不同类型的细胞有不同严格程度的裂解要求。如果未从细胞核中回收染色质，则需要执行更严格的裂解。这可以通过增加裂解缓冲液中的反应时间，在裂解缓冲液中进行短暂超声处理，或使用杜恩斯玻璃匀浆器来实现。

·如果选择使用超声处理，请始终将您的染色质放置于冰上，并且每次脉冲不要超过30秒，以确保蛋白质不会因过热而变性。

3、染色质制备（剪切/消化）

理想的染色质片段大小范围为200 - 700 bp；然而，DNA剪切是最难控制的步骤之一。超声处理提供真正随机化的片段，但其局限性包括：对专用机械的要求，可能需要调整、在超声处理期间难以保持温度、手动操作时间延长、大量的优化步骤。使用核酸酶进行酶促消化具有高度可重复性，更适合处理多个样品。然而，酶促消化可能由于酶活性的变化而导致存在差异性。酶对核小体间区域具有更高的亲和力，并且随机性较低。

剪切或消化染色质的技巧

·如果这是您第一次使用此细胞系，请确定细胞的剪切或消化条件。确定的方法是，使用已裂解细胞，并用不同数量的超声脉冲控制时间间隔进行超声，或控制核酸酶处理时间。接下来，通过用蛋白酶K 65°C恒温处理染色质，然后用RNase处理。再使用分离柱或苯酚-氯仿提取来纯化DNA，然后在琼脂糖凝胶上进行分析。随着时间的推移，您将看到DNA尺寸减小；选择存在250-700 bp范围内DNA最多的时间点。

·无论选择何种缩短染色质片段的方法，都要确认每个实验的染色质长度都在理想范围内。

4、免疫沉淀（最关键一步）

选择适当的抗体对于ChIP测定成功与否至关重要。如果针对某些靶标没有可用的抗体，则可以使样品表达与亲和标签（HA、Myc、His等）融合的蛋白质，然后使用针对亲和标签的抗体进行免疫沉淀。

为了减少背景干扰，通常在加入抗体之前，首先让裂解液与固相珠子一起预孵育数小时。每个ChIP样品中使用的珠子的体积也会影响背景，因为珠子体积增加会导致非特异性结合增加。延长孵育时间后，珠子-抗体-蛋白质-DNA复合物必须经充分洗涤并且通常用低盐和高盐缓冲液进行连续纯化。然后洗脱蛋白质-DNA复合物。

IP技巧

·并非所有的抗体都可用于ChIP。当您的目标蛋白质与DNA交联时，抗体识别的表位需要暴露，而不是掩盖在蛋白质-DNA复合物中。因此，理想情况下，您需要一种已证明可在ChIP、IP中起作用的抗体。

·单位染色质使用的抗体量也对ChIP效率存在影响。抗体过少和过多都会导致您的目标靶标的富集程度降低。

·在添加磁珠之前留下大约5%的样品。这一部分将作为您的input对照。

·IP后洗涤极为重要。洗涤不足会导致非特异性信号。

5、解交联和DNA纯化

富集与目标蛋白质结合的DNA是ChIP的目标。在对ChIP实验获得的特定DNA产物定量之前，必须对蛋白质和DNA解交联。解交联通常通过加热孵育和/或用蛋白酶K消化蛋白组分来完成。

6、DNA定量

ChIP的标志之一是通过qPCR定量纯化的DNA产物的能力。需要以解交联和纯化后2%的Input DNA（不稀释）、目的蛋白抗体IP后的DNA、IgG抗体IP后的DNA分别作为模板（各取未稀释的DNA 2ul），分别加入所要检测的目的基因对应的ChIP引物，进行定量PCR反应，并获得各自的Ct值。按照下面公式计算ChIP富集效率：

Percent Input = 2% x 2(C[T]2%Input Sample– C[T]IP Sample)

而IgG抗体IP后的DNA作为模板进行定量PCR反应获得的Ct值，作为阴性对照来衡量目的蛋白组的抗体富集是否达到显著差异，是否可以作为可信的结果。

通常，当抗体对特定基因位点（例如转录因子结合到目标启动子）的富集相对于用相同抗体对非特定基因位点（例如相同转录因子结合到非目标启动子）的富集要高至少4倍，相对于用Normal RabbitIgG #2729进行的特定基因位点的富集要高至少5到10倍时，我们定义ChIP结果为阳性。阳性ChIP实验可低至总input染色质的0.5%（例如转录因子和辅因子），高达总input染色质的40-50%（例如乙酰化和甲基化的组蛋白）。使用Normal Rabbit IgG，我们的磁珠和琼脂糖微珠的背景水平通常在染色质总input量的0.05 - 0.1%。