连发4篇！单细胞水平阐明长春花生物碱生物合成途径
长春花生产许多具有商业价值的萜类吲哚生物碱TIA，包括抗肿瘤药物长春碱（vinblastine）和长春新碱（vincristine）。自1970s将TIA作为抗肿瘤药物开发以来，长春花叶提取物一直是vindoline和catharanthine的唯一来源，这两种物质都是商业生产TIA单体的前体。广泛的研究表明，超过130种TIA是由长春花的中心前体strictosidine生产的（图1）。
图1.长春花中TIA合成通路
长春碱的合成过程仅发生在三种类型的叶细胞中：内部韧皮部相关薄壁细胞（IPAP）、表皮细胞（ECs）、异母细胞（IC）/乳汁管细胞（LC），具有典型的细胞特异性，因此原则上使用最新的单细胞组学技术可以直接获取不同细胞中代谢物积累的差异，从而可以更快速地阐明植物的生物合成途径。
2024年8月14日，Journal of the American Chemical Society在线发表了德国马普化学生态所Sarah E. O’Connor教授团队（2018年在Science上发表长春碱合成通路研究）对长春花不同组织进行单细胞水平代谢组研究。自2016年以来，由该团队和合作团队对长春花开展的单细胞水平研究发表了4篇文章，接下来我们一起来看下这4篇文章分别阐明的生物学问题。
第一篇
研究阐明的问题
TIA中间体在细胞水平上的实际定位是否与原位RNA杂交和免疫细胞化学定位推测的结果一致？
发表年份：2016年
研究技术：空间代谢组、单细胞代谢组、代谢组
原位RNA杂交和免疫细胞化学定位推测的结果
secoiridoid代谢开始于IPAP细胞，IPAP细胞中产生的loganic acid被转移到ECs中。在ECs中进一步合成secologanin和tryptamine。最后TIA中间体desacetoxyvindoline移动到IC和LC，并且TIA在这些细胞的液泡中积累。
本研究结果
研究结果表明loganin、secologanin分布在ECs细胞中，与原位RNA杂交和免疫细胞化学定位推测结果一致。但是在所有类型的细胞中均检测到Catharanthine，基于该结果推测catharanthine代谢可能不仅发生在EC中，也可能在IC和LC中合成（图2）。同时发现strictosidine也定位于IC和LC（图3），这表明strictosidine合成后可能会从EC转移到IC和LC。
图2.空间代谢组鉴定结果
图3.不同细胞类型单细胞代谢组鉴定结果
研究结论
TIA上游物质在细胞水平上的实际定位与原位RNA杂交和免疫细胞化学定位的推测结果一致，但是下游TIA中间体的积累呈现出的复杂分布模式，这表明负责合成的酶位于一种细胞类型中，但酶产物随后被转移到其他细胞。
图4.长春花茎组织TIA的细胞特异性定位
第二篇
研究解决的问题
长春花叶片组织TIA通路物质与茎组织中的定位是否一致？
发表年份：2019年
研究技术：空间代谢组、单细胞代谢组、代谢组
之前的其他研究结果：主要生物碱catharanthine > 95%定位于蜡层（Roepke et al .，2010;PNAS）
研究结果
空间代谢组结果表明loganic acid高度定位于维管束和表皮细胞附近，loganin和secologanin 定位于表皮细胞。空间代谢组和单细胞代谢组证实大多数TIAs包括vindoline和serpentine在异母细胞和乳汁细胞中积累，vindoline的生物合成始于叶原基，但叶原基的乳汁细胞没有积累足够的vindoline中间体来进行单细胞代谢组检测。catharanthine不仅存在于蜡层中，也存在于异母细胞和乳汁细胞中，可能从表皮细胞转运到异母细胞和乳汁细胞。
图5.空间代谢组结果
研究结论
TIA的组成在茎、叶原基和叶三者乳汁细胞中存在差异。在茎的乳汁细胞中没有检测到vindoline，也没有检测到vindoline的中间体如desacetoxyvindoline和deacetylvindoline，但在叶原基和叶组织的乳汁细胞中检测到vindoline。这些结果表明，vindoline生物合成途径可能仅在叶片扩张中起作用。
图6.长春花叶片组织TIA的细胞特异性定位
第三篇
研究解决的问题
长春花MIA在根和叶片中合成的差异以及MIA下游合成通路的完善
发表年份：2023年
研究技术：基因组、单细胞转录组、单细胞代谢组、转录组
研究结果
单细胞转录组结果表明MIA合成通路基因在叶片中三种细胞类型间有明显的分隔（MEP和环烯醚酮阶段在IPAP中表达，生物碱部分在表皮中表达，最后已知步骤仅在异母细胞中表达），但在根中则是分散于皮层、表皮层和基底组织细胞中。
图7.长春花叶片和根系单细胞转录组基因表达分布分析
单细胞代谢组结果表明在异母细胞中积累的主要代谢物浓度在毫摩尔范围内，其中catharanthine的平均浓度为100 mM，特别之处在于产生这种代谢物的酶（catharanthine synthase （CS））位于表皮，但仅在少数表皮细胞中检测到少量的catharanthine。同时catharanthine和vindoline的浓度比AHVB（anhydrovinblastine）和vinblastine高两个数量级，所以生成双吲哚生物碱的偶联反应很可能是一个限速步骤，这可能是由于偶联酶的低表达和低比活性，或者是由于两个单体的细胞内区隔化阻碍了偶联。
图8.典型的MIA物质在细胞中积累的含量
研究结论
MIA生物合成基因在叶片和根部的细胞类型表达谱不同，凸显了器官间基因表达网络的可塑性，以及MIA生物合成通路在基因表达水平上的新功能化和亚功能化。
第四篇
研究解决的问题
长春花根、叶、花各个组织部位细胞水平基因表达和物质分布差异
发表年份：2024年
研究技术：单细胞转录组、单细胞代谢组、代谢组
研究结果
不同组织的单细胞代谢组HCA图表明少数细胞高度富集生物碱，而大量细胞积累黄酮类化合物，secologanin和较低浓度的生物碱。
图9.不同组织单细胞代谢组部分典型代谢物HCA图
使用20种天然产物的峰面积将每个组织的细胞群分成四个簇，这一分析表明所有组织都有专门从事单萜吲哚生物碱积累的细胞。然而，环烯醚酮、类黄酮和花青素化合物在这些组织中表现出不同的共定位模式。
图10.不同组织和品种间细胞群代谢谱的比较
研究结论
根和花瓣的单细胞代谢组和单细胞转录组数据的比较表明，在这些组织中，生物合成基因的表达并不总是与代谢物积累的部位相关。根中生物合成基因的表达表明，环烯醚萜类化合物与下游生物碱存在于相同的细胞类型中，但单细胞代谢组数据显示生物碱与上游环烯醚萜类化合物存在于不同的细胞类型中。虽然在花瓣细胞中观察到高水平的生物碱，但生物合成基因的表达却很低，这表明这些化合物是从其他组织转运来的，或者是在花发育的不同阶段合成的。总的来说，scRNA-seq和scMS数据的比较强烈地表明存在许多活跃的细胞间运输过程。
迈维小结
从以上4篇的研究中我们可以发现，在植物特异性物质的研究中，利用单细胞代谢组可以解决以下生物学问题：
1.物质在组织内的不同细胞间是否具有差异分布，这种分布是否在不同组织间具有相似性？
2.酶的分布决定了物质的合成区域，但最终积累区域是否和合成区域一致？
3.物质合成限速是因为酶的活性还是因为区隔分布？
而与单细胞转录组结合则可以快速完善植物代谢通路的构建，在基因筛选上更为有效（避免部分细胞特异性表达的基因在组织转录组检测结果中被判定为无变化的基因）；与空间代谢组结合则可以相互佐证及弥补物质无法使用单一方法鉴定的问题。