糖酵解+炎性小体凭4张图拿下Cell子刊还是生物学一区TOP？！

我亲爱的宝子们好呀~我想如果羡慕有声音，那小薇的羡慕肯定震耳欲聋了！为什么这么说呢？害~小薇刚刚看见一篇文章，发表在《Cell Reports》(IF=7.5)上，顺手一翻，这下不得了了，怎么就4张图片啊，全文满打满算全是数的过来的工作量，还没仔细阅读呢我就觉得我又行了！是骡子是马拉出来溜溜~赶快跟小薇一起一探究竟吧！

1、本文基于NLRP3和KEAP1（一种氧化应激反应性转录因子NRF2的负调节因子）都感应来自外源性和内源性的亲电化学物质，因此假设“NLRP3也感应并响应糖酵解代谢物”展开研究，通过ASC斑点测定、免疫印迹和免疫沉淀、质谱分析等经典方法步步论证；

2、本文的创新性主要在于：①鉴定了CBR-470化合物对PGK1（糖酵解酶磷酸甘油酸激酶1）的抑制抑制NLRP3炎性小体的组装；②证明了糖酵解副产物甲基乙二醛（MGO）的积累抑制炎性小体；③揭示了一种炎性小体的调节机制——CBR-470化合物系列通过MGO依赖性共价交联和NLRP3失活抑制NLRP3炎性小体组装。（ps：想要相关热点方向的课题设计评估和生信分析小伙伴们速来扫码联系小薇哦~期刊“水不水”都没关系，小薇助力宝子们用最顶的思路发最顶的期刊！）

题目：糖酵解代谢物甲基乙二醛共价灭活NLRP3炎性小体

杂志：Cell Reports

影响因子：IF=7.5

发表时间：2024年9月

公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20240924

研究背景

炎性小体是受模式识别受体控制的大型胞质蛋白复合物，对调节促炎细胞因子和焦亡细胞死亡的水平至关重要。一种这样的炎性小体由NLRP3（包含NOD-、LRR-和pyrin结构域的蛋白3）成核，NLRP3对各种危险和病原体相关的分子模式做出反应。因此，NLRP3仍然是一个有前途的药物靶点，有可能减轻许多炎症状况的病理。然而，目前还没有临床批准的NLRP3抑制剂，尽管有几种正在临床上进行评估。

研究思路   

研究结果

1.药物PGK1抑制剂阻断NLRP3炎性小体组装和活性

首先，用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950预处理可以剂量依赖性地抑制ASC-GFP斑点的形成。用CBR-470-1或CBR-470-2预处理2小时，分别抑制半抑制浓度为25和3 μM的细胞中ASC-GFP斑点的形成。这两种PGK1抑制剂的抑制作用与MCC950的相似，通过增加预处理时间超过2小时，可以观察到抑制作用的微小增加。接下来确定了这些化合物抑制NLRP3炎症小体依赖活性的潜力，包括caspase-1激活、IL-1b分泌和焦亡细胞死亡。用HEK293-BBR-470-2细胞预处理2小时，抑制了THP1细胞和原代树突状细胞的IL-1b分泌，使用IL-1b报告细胞（图1D和1E），并降低了caspase-1活性。CBR-470-1或CBR-470-2作用2小时也在细胞中阻断了黑细胞素诱导的焦细胞死亡（图1F）。这些结果表明，两种PGK1抑制剂阻断NLRP3炎症小体组装和下游信号传导。由于CBR-470-1比CBR-470-2表现出更好的效力，研究者们将重点放在CBR-470-2上进行进一步的机制实验。    

图1 CBR-470系列化合物抑制NLRP3炎性小体

2.CBR-470-2依赖性NLRP3抑制与NRF2激活和NF-κB抑制无关

由于NRF2的激活抑制了火焰小体中的NLRP3,研究者们试图确定该化合物观察到的对NLRP3组装和活性的抑制是否与NRF2的激活有关。CBR-470-2处理2h后，并没有诱导THP1细胞中NRF2靶基因NQO1的表达（图2A）。为了进一步探索化合物依赖的NLRP3抑制对NRF2的依赖，研究者监测了NRF2抑制剂ML385预处理30 min和CBR-470-22h的THP1细胞中ASC-GFP斑点形成和焦细胞死亡。在这些检测中，ML385预处理并不影响CBR-470-2依赖性抑制NLRP3炎症小体组装或活性的效力或效力（图2B和2C）。这表明CBR-470-2对NLRP3炎性小体的抑制并不是通过NRF2的激活来介导的。接下来确定了CBR-470-2对LPS启动诱导的NLRP3炎症小体成分的NF-kb依赖性表达的潜在影响。与CBR-470-2共处理3或24小时并不影响LPS启动的THP1细胞中NLRP3的表达，尽管它确实会适度降低pro-IL1b的表达（图2D）。然而，在LPS引发的THP1细胞中用CBR-470-2处理2小时后，NF-κB靶标的蛋白质水平，包括NLRP3、ASC和pro-IL-1β以及其他NLRP3炎性小体成分没有显着降低（图2E和2F）。这些结果表明，CBR-470-2不会影响LPS启动诱导的NF-κB靶基因的表达。    

图2 CBR-470-2对NLRP3炎性小体的抑制不依赖于NRF2激活或NF-κB抑制

3.CBR-470-2通过增加PGK1下游MGO的产生来抑制NLRP3

接下来监测了与CBR-470-2和谷胱甘肽（GSH）共处理的THP1细胞中的NLRP3炎性小体组装（通过ASC-GFP斑点形成），后者是一种中和反应性代谢物的处理。与GSH的共处理消除了CBR-470-2对ASC-GFP斑点形成的抑制（图 3A）。这支持了一种模型，即这些PGK1抑制剂通过一种涉及诸如MGO等反应性代谢物积累的机制来抑制炎症小体内的组装。研究者们通过RT-qPCR证实了siRNA处理降低了这些细胞中PGK1的表达（图3B）。所有三种siRNA所提供的PGK1的减少减少了THP1细胞中ASC-GFP斑点的形成（图3C）。这表明，PGK1基因的缺失再现了PGK1药物抑制诱导的NLRP3炎症小体组装的减少。接下来用浓度递增的MGO处理THP1细胞，并使用ASC-GFP斑点形成测定法监测NLRP3组装。MGO预处理2 h抑制了IC~0.52 mM NLRP3炎性小体组装。然而，NRF2抑制剂ML385预处理并没有降低对ASC-GFP斑点形成的抑制作用，也没有降低MGO处理对焦亡细胞死亡的保护作用（图3D）。此外观察到，经CBR-470-2处理的THP1细胞中，MGO迅速增加，但处理后8h下降（图3E）。这些结果表明，CBR-470-2通过抑制PGK1和随后积累MGO的机制来抑制NLRP3炎症小体的组装。    

图3 CBR-470的抑制是由PGK1抑制和甲基乙二醛的积累介导的

4.MGO通过MICA修饰诱导NLRP3单体的分子间和分子内交联

CBR-470-2处理增加了HEK293T细胞中的HMW NLRP3-FLAG。此外，CBR- 470-2处理增加了THP1细胞内源性NLRP3交联，可溶性NLRP3减少和不溶性HMW NLRP3增加（图4A）。NLRP3包含多个结构域，在HEK293T细胞中表达缺乏这些单独结构域（例如 DPYN、DNBD、DLRR）或每个单独结构域的NLRP3-FLAG构建体，并监测用CBR-470-2或MGO处理诱导的交联。所有这些构建体都显示用CBR-470-2或MGO处理的细胞中HMW条带增加（图4B）。研究者们在HEK293T细胞中过表达了结构域内缺乏所有Cys残基的PYN结构域，并通过免疫印迹法监测CBR-470-2处理诱导的交联。这表明，所有Cys残基的丢失阻止了CBR-470-2依赖的PYN交联的增加（图4C）。在CBR-470-2-和MGO处理的分离株C08-R43、C08-R81、C38-R07、C108-R89、C138-R89和C130-R126分离株中观察到相应的MICA质量添加（36 Da），而从未处理细胞中分离的PYN单体条带中未观察到（图4D-4G）。这表明，除了SDS-PAGE观察到的分子间交联（HMW条带明显）外，CBR-470-2处理也会导致分子内交联。这种交联的混合表明，NLRP3对糖酵解扰动高度敏感，导致多个位点的MGO修饰，以抑制NLRP3炎症小体的组装和活性。    

图4 CBR-470-2通过MICA交联抑制NLRP3

文章小结

总之，本研究：①表明PGK1的抑制导致甲基乙二醛的积累，甲基乙二醛是一种反应性代谢物，其水平升高会降低细胞中的NLRP3组装和炎症信号传导；②甲基乙二醛通过非酶促、基于共价交联的机制使NLRP3失活，促进NLRP3内的蛋白间和蛋白内MICA（半胱氨酸和精氨酸之间的甲基咪唑交联）翻译后键；③确定了NLRP3能够感应许多亲电化学物质，包括外源性小分子和内源性反应性代谢物，并提出了一种机制，糖酵解通量可以调节中枢炎症信号通路的激活状态。对相关的研究热点和思路感兴趣的宝子们快来扫描下方二维码联系小薇吧！这些数据就能发一区TOP别说你不羡慕，别人有的咱也要有~来Call小薇吧，速速安排！