哈喽大家好，小薇今天要给大家分享一篇精氨酸甲基化的热点研究，赶紧带上你的小笔记本，和小薇一起学习吧！

精氨酸甲基化是一种在细胞过程中重要的翻译后修饰，蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）已成为可成药靶点，是目前国家自然科学基金资助的研究热点。对精氨酸甲基化在疾病中的作用进行探究，可以帮助揭示新的疾病机制，为疾病的预防、诊断和治疗提供新的策略和靶点。

环状GMP-AMP合酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号转导触发I型干扰素（IFN-I）反应并能激发T细胞功能。有研究表明STING激动剂的给药阻断了体内模型中急性髓系白血病（AML）的发展。但STING激动剂的临床疗效不佳，因此迫切需要开发一种基于刺激癌症内源性cGAS的策略。

多的不说，小薇来给大家呈上一篇实例文献：2024年2月27日，美国希望之城国家医学中心李凌课题组在Nature Cancer（IF：23.5）上发表题为“Targeting PRMT9-mediated arginine methylation suppresses cancer stem cell maintenance and elicits cGAS-mediated anticancer immunity”的研究性论文。希望通过本次文献分享让各位小伙伴深入理解这类研究方向的思路和方法。

1.研究以AML为研究对象，利用单细胞测序+质谱流式+荧光素酶报告基因检测+多聚核糖体分析等技术方法，揭示了PRMT9（蛋白质精氨酸甲基转移酶）在白血病干细胞（LSCs）和非LSCs的存活和免疫逃逸中的作用机制。阐明了靶向PRMT9可能是一种有前途的潜在抗癌策略。

2.本研究还开发了一种阻断PRMT9活性的小分子抑制剂。研究不但促进了抗癌药物的评估，PRMT9抑制联合PD-1/PD-L1抑制剂抗急性髓系白血病（AML）的疗效结果更为临床治疗AML提供了新的思路与方法。PS：各位友友！小薇今天的研究热点和思路已送达，如果想复现或者有其他不懂的地方，可以联系小薇！无论设计思路还是生信技术小薇都手到擒来！联系小薇为你制定详细计划，让你在科研道路上一帆风顺！

题目：靶向PRMT9介导的精氨酸甲基化可抑制癌症干细胞维持并引发cGAS介导的抗癌免疫  

杂志：Nature Cancer

影响因子：IF=23.5

发表时间：2024年2月

公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20240926

研究背景

目前，急性髓系白血病（AML）患者的预后仍然很差。异基因造血干细胞移植成为唯一的治疗方法。然而，它的适用性受到了限制。免疫疗法的成功为开发有效的抗白血病药物提供了新的思路，包括免疫检查点抑制剂（ICIs）。然而，将现有的T细胞利用策略转化为AML治疗仍然具有挑战性。环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号转导可触发I型干扰素（IFN-I）反应并能启动T细胞的功能。蛋白质精氨酸甲基化是细胞过程中的一种翻译后修饰功能10。蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）已成为可药物化的靶点。而PRMT9是一种不太广为人知的PRMT。本研究旨在PRMT9在癌症中的生物学作用。    

研究思路

研究结果

1.AML患者PRMT9水平升高

作者首先使用癌症基因组图谱（TCGA）程序和癌细胞细蛋白质组数据集评估了PRMT的水平，发现在多种肿瘤中AML的PRMT9 mRNA和蛋白质表达水平，通过数据集分析显示PRMT9主要在白血病干细胞（LSCs）中表达，并且与AML预后相关（图1a-c）。随后，作者对MLL-AF9 (MA9) cKit+细胞移植小鼠模型的小鼠白血病骨髓进行了scRNA-seq分析，共鉴定出两个LSCs和原始细胞簇，并发现在LSCs中PRMT9是唯一一个水平比原细胞高出一倍以上的PRMT（图d-f）。接着作者通过评估AML标本和正常健康供体（外周血干细胞）中的PRMT9水平，发现PRMT9蛋白水平在AML CD34+亚群细胞中更高，且与任何特定的细胞遗传学异常或突变无关（图1g-i）。作者的研究发现PRMT9水平越高，总生存期越短（图1j-k）。    

图1AML患者PRMT9水平升高    

2.敲低PRMT9会损害癌细胞的存活

作者生成了PRMT9-cKO/MA9小鼠，发现MA9小鼠骨髓cKit+细胞中PRMT9水平升高，敲低PRTM9会抑制骨髓细胞的集落形成细胞（CFC）生长；PRMT9缺陷小鼠AML进展较慢，肿瘤负荷较低，脾肿大减少，具有生存优势（图2a-h）。作者进一步评估了PRMT9在人类癌症中的功能作用，通过设计Molm13细胞来表达野生型(WT)PRMT9或相应的催化死亡突变体（MUT）PRMT9，发现，PRMT9/WT-R与PRMT9/MUT-R转导不同，其可逆转PRMT9敲低后的抑制作用，表明PRMT9发挥作用需要催化活性（图2j-k）。同时发现与正常对照相比，敲低PRMT9更有效地降低了AML CD34+细胞的活力（2l-o）。将含有多西环素（DOX）诱导shPRMT9结构的Molm13细胞移植到NOD scid gamma（NSG）小鼠体内，结果显示敲低PRMT9细胞的小鼠白血病负担减轻，存活时间延长（图2p-r）。    

图2PRMT9的消融会损害癌细胞的存活

3.PRMT9介导的甲基化促进细胞生长

作者通过对可诱导的shPRMT9转导或shCtrl转导的Molmm13细胞进行氨基酸稳定同位素标记细胞培养（SILAC）偶联蛋白质质谱以及蛋白甲基化质谱分析。分析结果显示315个独特的甲基化精氨酸（MMA）和109个二甲基化精氨酸（DMA）位点，敲低PRMT9可导致独特蛋白中16个DMA和MMA位点显著下调（图3a-c）。在23个蛋白中，10个具有RNA翻译功能，7个与DNA损伤反应相关，6个与RNA分解代谢相关（图3d）。作者接着探究PRMT9是否调节翻译，通过蔗糖密度梯度测定和O-丙炔-嘌呤霉素（OPP）蛋白合成测定，发现敲低PRMT9可抑制多聚体mRNA翻译和蛋白质合成（如c-Myc、SAMHD1、RUNX1等短周期蛋白的合成减少（图3e-h）。进一步鉴定下调的甲基化肽，发现具有二甲基r493的甲基化的PABPC1肽（R493me2）在PRMT9 KD中消耗最多。通过体外甲基化实验发现PRMT9可促进位于PABPC1与mRNA polyA结合区域的R493位点甲基化，而残基R493的甲基化使PABPC1蛋白能够与mRNA多聚(A)尾部结合，促进翻译。为了评估PABPC1甲基化的功能，作者异位表达了全长PABPC1 WT、PABPC1-3RK或PABPC1-R493K突变体，这些突变体对shPABPC1具有抗性，并进一步敲除内源性PABPC1。接着作者生成了一种抗体来检测R493位点的二甲基化，发现内源性PRMT9的敲除可以阻断PABPC1 R493的甲基化，但不能阻断R455或R460的甲基化（图3u）。CD34+细胞表达的PRMT9和R493甲基化水平高于母细胞，且PABPC1 R493甲基化与PRMT9水平呈正相关（图3v-w）。    

图3PRMT9介导的甲基化促进癌细胞的生长

4.PRMT9抑制剂的鉴定

作者从美国国家癌症研究所（NCI）和ZINC文库中筛选了与PRMT9亲和力强的化合物；并选择具有强大细胞抑制作用的前20个化合物进行下一步分析（图4a-c）。评估了这些化合物对PRMT9催化作用的影响，发现NSC641396对PRMT9的抑制效果最高，在去除醌环并在咔唑部分的不同位置引入杂原子后获得69种化合物，其中只有1号、2号和8号显示出优于或类似于NSC641396的PRMT9抑制效力，其中1号（称为LD2）最有效。接下来作者利用核磁共振（NMR）证实了LD2与PRMT9蛋白的直接相互作用（图4d-g）。并利用细胞热位移测定法评估了LD2与PRMT9蛋白的细胞内相互作用，发现LD2处理导致PRMT9 WT的热稳定性发生了实质性变化，而PRMT9突变体则没有（图3h-i）。    

LD2治疗优先抑制癌细胞的活力及蛋白质的合成，相对较低剂量的LD2降低了PRMT9的活性，而保留了其他PRMTs的活性，分子动力学模拟证实了PRMT9较其他PRMT与LD2的结合力更强（4i-k）。接下来，作者在生理细胞因子条件下，用LD2处理AML标本中的单核细胞(MNCs)4天，然后通过质谱流式分析（CyTOF）分析，结果显示在这些免疫细胞和白血病细胞共培养中，LD2处理减少了白血病细胞，并相对增加了T细胞比例（图4m）。为了分析PRMT9活性与T细胞功能之间的相关性。作者分析了GSE12417 - GSE14468的RNA-seq结果并使用已报道的43个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)评分，发现PRMT9水平呈负相关（图o-p）。    

       图4PRMT9抑制剂的鉴定

5.验证敲低PRMT9在AML治疗中的作用

为了评估癌症内在的PRMT9抑制是否会诱导免疫反应，作者使用了MA9 AML移植模型。在WT B6、Rag2 KO和NSGS小鼠中植入后给予DOX。结果显示免疫缺陷的Rag2 KO和NSGS小鼠存活时间明显长于移植PRMT9 WT的小鼠，但在60天内死于白血病；而接受PRMT9 KD移植的7只B6小鼠中有5只存活至第120天（图5a-f）。为了验证敲低PRNT9在不同的AML模型中的作用，作者使用了CMM移植模型。发现敲低PRNT9介导的白血病消除效应在两种模型中具有可比性，敲低PRNT9显著降低了白血病起始细胞频率（图5d-g）。    

为进一步证实敲低PRNT9引起的T细胞免疫反应并清除肿瘤细胞的机制，作者对MA9肿瘤微环境进行了scRNA-seq分析，结果发现敲低PRMT9降低了肿瘤细胞数量，并诱导T细胞活化。通过分析T细胞更丰富的脾脏的scRNA-seq结果。敲低PRMT9改变了T细胞亚群的比例，减少了初始T细胞亚群，增加了效应T细胞和记忆T细胞数量（图5n-r）。为了评估免疫记忆，作者在敲低PRMT9存活的原代B6小鼠中注射相同数量的MA9细胞，结果表明存活的小鼠体内存在记忆T细胞，表明敲低PRMT9 是通过激活机体的T细胞发挥抗肿瘤作用的（图5s）。基因集合集分析（GSEA）结果显示T细胞中IFN反应通路激活，并通过将PRMT9 KD MA9细胞移植到WT受体或I型IFN受体KO小鼠中（Ifnar1 KO）进行验证，发现Ifnar1 KO背景下，PRMT9 KD的抗AML作用显著被消除（图5u-v）。    

图5敲低PRMT可在体内发挥抗AML作用

6.PRMT9抑制后的免疫力依赖于cGAS活性

通过分析MA9细胞的scRNA-seq转录组，作者观察到PRMT9 KD后多个干扰素刺激基因（ISGs）的表达上调，GSEA分析显示，PRMT9 KD后的IFN-α和IFN-γ通路富集，AML细胞系的转录组分析证实了通过靶向PRMT9来实现的先天免疫信号激活（图6a-c）。为了确定先天免疫激活是否与PRMT9活性相关，作者比较了内源性PRMT9在KD后过表达WT或催化突变体PRMT9的Molm13细胞中ISG的表达。发现只有PRMT9 WT的表达促进 ISGs的上调（如ISG15，IFI44），LD2处理液刺激了ISG的表达（图6d-e）。作者使用THP1-Lucia 荧光素酶监测先天免疫传感器下游的IFN调节因子（IRF）信号，包括双链DNA（dsDNA）传感器cGAS或dsRNA传感器。结果显示PRMT9 KD或LD2处理增加了萤光素酶信号；而cGAS的缺失可阻断这种增加效应；PRMT9 KD也增强了cGAS活性及γH2AX水平，表明DNA损伤，并促进了细胞质dsDNA的积累（图6f-i）。    

为进一步研究cGAS在PRMT9中的作用，作者发现敲除cGAS后PRMT9 KD诱导的ISG激活被抑制，PRMT9 KD的THP1细胞中DNA损伤严重，胞内dsDNA积累，cGAMP增加。随后作者探究了PRMT9 KD介导的免疫是否需要肿瘤固有的cGAS活性。结果显示cGAS KO小鼠在PRMT9 KD后没有显示出肿瘤特异性的T细胞反应，生存优势不存在（图6j）。通过cGAS激活突变体（ΔN）检测了cGAS在癌细胞中的激活结果。在ΔN移植中发现AML负荷减少，AML细胞显示cGAS激活的小鼠的存活率显著延长，AML中cGAS水平显著较高（图6k-n）。总之，这些结果表明敲低PRMT9的抗肿瘤免疫依赖于cGAS的活性。    

图6PRMT1介导的meR206-PGK1与结肠癌患者恶性进展和不良预后呈正相关。

7.XRN2甲基化的缺失是cGAS激活的基础

通过LD2（48h）或shRNA抑制THP1细胞中的PRMT9可显著增加Rad3相关（ATR）信号通路、γH2AX升高和失调性毛细血管扩张症突变（ATM）信号通路的变化；表明敲低PRMT9导致了选择性激活ATR的早起损伤（图7a-c）。作者接下来探究了是否有某种PRMT9底物在DNA损伤反应中发挥作用，以及它的缺失是否是ATR激活和cGAS刺激的基础。通过荧光素酶检测报告和体外甲基化实验证实了PTRMT9对XRN2、DDX3X和KHDRBS1（图3中所发现的甲基化蛋白）有催化作用（图7d-e）。    

进一步的研究发现XRN2-R946K表达增加了THP1报告基因的活性，而cGAS缺失可阻断这种作用，甲基化缺失的DDX3X没有增加报告基因的活性（图7h）。基于体外甲基化和对LD2处理的反应，作者证实了XRN2-R946K被PRMT9甲基化（图7i-j）。接着作者重点研究了外核糖核酸酶XRN2。为了确定R946甲基化是否促进了p54nrb对XRN2的募集，作者通过Co-IP分析发现在R946K存在时，flag标记的XRN2与p54nrb的相互作用削弱。最后作者通过斑点印记、免疫荧光和细胞周期分析等试验证实了XRN2甲基化的缺失导致PRMT9抑制并导致DNA损伤（图7k-r）。

图7XRN2甲基化缺失是cGAS激活的基础

8.LD2和ICI联合可治疗AML

作者综合scRNA-seq结果和现有研究报道的相关免疫检查点蛋白，通过敲低PRMT9显著上调了细胞中的PD-L1（图8a-b）。为了确定PRMT9抑制剂是否与PD-1单克隆抗体（mAb）治疗有协同作用，作者在体外处理AML样本4天后发现联合治疗可引起T细胞扩增及激活，降低肿瘤细胞发生频率（图8d-g）。接下来，作者评估了在MA9 AML移植模型中的联合治疗作用。结果显示，与单独作用的LD2相比，联合治疗显著降低了白血病的移植和扩大了肿瘤特异性T细胞，并降低LSC的活性，延长了小鼠的存活期（图8h-l）。作者还利用临床数据集评估了PRMT9活性与PD-1和PD-L1抑制剂作用疗效之间的相关性，结果显示在两个临床队列中，较高水平的PRMT9 KD基因标记与ICI的完全应答(CR)和进展性疾病(PD)呈正相关（图8q-r）。    

图8XRN2甲基化缺失是cGAS激活的基础

文章小结

综上所述，本研究探究了PRMT9在癌症中的生物学作用。开发了一种阻断PRMT9活性的小分子抑制剂。研究还提示了对抗癌药物的评估，并考虑了其对肿瘤微环境中免疫细胞的影响，并为进一步评估PRMT9联合PD-1/PD-L1抑制剂抑制AML提供了理论依据。该研究提示靶向PRMT9可能是一种潜在的治疗ANL的策略，为AML的临床治疗提供新的见解与思路。干湿结合在癌症免疫治疗中的应用十分广泛，想复现思路的朋友，速速来联系小薇吧！小薇从事科研设计、生信服务工作多年，有需要的一定要先下手为强，快扫描下方二维码联系吧！