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慢性代谢应激会引发促肿瘤信号，促进癌症干细胞（CSCs）的发展。因此，阐明癌症细胞干性的代谢传感和信号传导机制可以为改善癌症复发和治疗耐药性提供见解。为了让各位友友能快速地学习并复现热点研究，小薇师姐今天特地为大家寻找了一篇发表在“Cell Death & Disease”上题为“Tolerable glycometabolic stress boosts cancer cell resilience through altered N-glycosylation and Notch signaling activation”的研究论文。该研究的亮点：

1. 生信分析+机制实验——干湿结合。多组学揭示了暴露于轻度糖代谢应激的癌症细胞中N-聚糖谱和Notch信号激活的特性变化。机制实验：通过补充葡糖胺和甘露糖以及阻断Notch信号传导来恢复N-聚糖组装，可减弱CSCs样特性，并进一步增强顺铂的治疗效果。

2.研究揭示了耐受的糖代谢应激能通过改变N-糖基化和Notch信号激活来增强癌症细胞的恢复能力。这种基于代谢的癌症治疗可能是减少耐药CSCs群体的一种新策略。PS：目前纯生信的文章发文难度正在不断增加，与此同时机制类研究也就也越来越离不开生信，最终共同促成了一种发文趋势——干湿结合。各位友友想要快速发文的话，光靠漫长的机制实验是远远不够的，你得结合易上手的生信分析。如果你正在为课题设计而苦恼？亦或是不会生信分析而停滞不前。你就赶紧扫码联系小薇师姐！小薇师姐陪你一起破茧成蝶，早日拿到毕业的通关文牒！

题目：可耐受的糖代谢应激通过改变N-糖基化和Notch信号激活来增强癌细胞的恢复能力  

杂志：Cell Death & DIsease

影响因子：IF=8.1

发表时间：2024年1月

公众号回复“123”领取原文PDF，文献编号：20240928

研究背景

癌症干细胞（CSCs）是导致癌症复发和治疗耐药性的原因，是癌症治疗的潜在靶点。已有研究报道代谢应激在控制非干细胞肿瘤细胞和CSCs之间的动态相互转换中发挥重要作用。然而，到目前为止，对于代谢应激反应是如何有助于CSCs的出现、维持和治疗耐药性的作用机制尚不明确。异常糖基化是癌症的一个标志，在调节癌细胞增殖、转移、免疫逃避和多药耐药性中起着关键作用。透明质酸（HA）是细胞外基质中的一线性多糖，HA的积累与晚期癌症患者的不良预后相关。本研究主要探究HA生物合成控制的CSCs代谢调节的可能分子机制。    

研究思路

本研究首先通过糖组学研究确定HA过量产生癌细胞的糖型特征，通过体外、体内实验阐明了改变的N-糖基化通过激活Notch信号通路促进CSCs样特性和化学抗性的机制。主要研究思路及内容如下所示：

研究结果

1.细胞糖组学揭示了与HHA过量产生相关的N-连接糖基化的特征性变化  

整合组学数据集有助于全面理解CSCs调控的分子机制。作者首先通过糖组学分析以确定HA过量产生的癌细胞的糖型特征。通过比较三种具有不同HA-产生能力的乳腺癌细胞系的糖型（包括来源于小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)-Neu转基因（Tg）小鼠乳腺肿瘤的亲本Neu癌症细胞和两种原代乳腺癌细胞系HA-low Has2和HA-high Has2）。全细胞糖组学图谱显示在HA-high Has2细胞中，N-聚糖谱发生了改变，而亲本Neu和HA-low Has2细胞的图谱相似（图1A-D）。    

图1具有不同HA产生能力的乳腺癌细胞系中的N-聚糖谱

2.HA过量产生的癌细胞中N-聚糖前体物质减少

由于HA和N-聚糖的生物合成途径共享共同的供体底物UDP-GlcNAc，因此HA的过量生产可能通过消耗核苷酸糖来影响蛋白质的N-糖基化，作者使用离子对反相高效液相色谱法检测了HA-low Has2和HA-high Has2细胞中核苷酸糖水平，结果显示Has2细胞中UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA的细胞水平明显低于Has2细胞（图2A-B）。细胞内核苷酸糖库受到葡萄糖代谢的综合调控（图2C）。主要的核苷酸糖细胞图谱表明了一种抵消机制，通过该机制在核苷酸糖类供应失衡的情况下，细胞平衡核苷酸糖的供应。UDP-Glc、UDP-GlcNAc和GDP-Man是N-聚糖前体生物合成的必要底物，它们水平的降低可能干扰成熟LLOs的完全组装，从而改变N-聚糖的生物合成。因此，作者探究了HA的产生是否影响LLOs的生物合成。结果显示HA-high Has2细胞的成熟产物GlcManGlcNAc-PP-Dol的数量显著低于亲本Neu和HA-low Has2细胞。Neu和Has2细胞显示出不同的未成熟LLOs的特性，而成熟LLOs水平没有显著降低（图2E-G）。综上，这些结果表明，成熟LLOs水平的降低是HA-high Has2ΔNeo细胞N-糖基化改变的原因。    

图2具有不同HA产生能力的乳腺癌细胞系中核苷酸糖和LLO的细胞水平

3.低剂量TM长期预处理增强CSCs样特性个化疗耐药性

基于HA的过量产生已被证明会增加CSC样细胞的数量，作者假设过量的HA产生可能会通过减少LLOs组装促进从非CSCs向CSCs的转化。为了确定低剂量TM长期预处理对LLO组装的部分抑制是否影响CSC转化，作者用不同浓度的TM对HA-low Has2+Neo癌细胞进行预处理8天，并评估了它们对CSC样特性的影响。发现用低剂量TM（0.1 µg/ml）进行长期预处理部分干扰成熟LLO在Has2细胞中成熟LLOs的组装，使其达到与HA-high Has2细胞相当的水平。糖组学和层次聚类分析也表明低剂量TM的预处理使n-聚糖的组成更接近于Has2细胞,且低剂量TM预处理以剂量和时间依赖性的方式增加了CD44/CD24SCs样细胞的数量恢复到未处理细胞中观察到的水平（图3A-B，图4A-B），这些结果表明TM增强的CSC样特性是可逆的，而不是由于TM抗性细胞的克隆选择。2-DG可抑制糖酵解中间体Glc-6P and Fru-6P的合成，并通过抑制己糖激酶（HK）和葡萄糖-6-磷酸异构酶（PGI）的功能干扰LLOs的组装。作者还评估了反映乳腺CSCs自我更新活性的乳腺球（mammosphere）的形成。与CD44/CD24CSC样细胞数量增加一致，用低剂量TM（0.05和0.1 µg/ml）预处理在更大程度上促进了乳腺球的形成（图4D）。    

CSCs对传统化疗药物具有高度耐药性，被认为是治疗后肿瘤复发的原因。用化疗药物顺铂处理HA-high Has2和HA-low Has2癌症细胞，通过荧光膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）双染色测定早期和晚期凋亡细胞的数量。发现HA-low Has2细胞的早期和晚期凋亡细胞数量显著增加，而HA-high Has2细胞对该剂量相对耐药。作者还研究了TM或2-DG预处理对化疗耐药性的影响。结果显示低剂量TM或2-DG预处理均可显著减轻顺铂诱导的HA-low Has2癌细胞的凋亡（图5A-C）。    

图（3-5）低剂量TM长期预处理增强CSCs样特性个化疗耐药性

4.基因表达信号的差异富集显示了在糖代谢应激下Notch信号的激活

随后作者通过RNA-seq转录分析确定糖代谢应激下的基因表达特征。低剂量TM-和2-dg预处理细胞进行RNA-seq数据（16478个基因）的分层聚类结果显示两种预处理细胞之间的转录组谱相似，在TM-和2-dg预处理细胞中，只发现了5个差异表达基因（DEGs）。随后使用来自MSigDB数据库的标志性基因组数据进行基因组富集分析（GSEA）以比较TM预处理和未处理的细胞。GSEA功能分析揭示了TM预处理细胞中与“Notch信号传导”和“WNT/β-catenin信号传导”相关的基因特性的富集模式（图6A-C）。作者的结果显示Notch3是上调最多的基因，而DLL1和Notch1在Notch信号数据集中和WNT/β-连环蛋白信号数据集中均普遍上调。KEGG分析结果显示TM预处理细胞中Notch信号的上调，Notch受体、配体和靶基因如Hey和Hes的表达增加。qRT-PCR证实了TM和2-DG预处理细胞中Notch3的显著上调（图6D-E）。为研究Notch信号通路在CSC功能中的作用，作者用Notch信号抑制剂处理Has2细胞，结果显显示Notch抑制剂以剂量依赖性的方式减弱了乳腺球的形成（图6G）。为了解决Notch信号是否也促进了化疗耐药性，作者还通过凋亡实验评估了一种有效的Notch抑制剂（LY411575）和顺铂对细胞毒性的协同作用。发现LY411575增强了顺铂对Has2ΔNeo细胞的细胞毒性作用（图6H）。这些结果表明，糖代谢应激部分通过Notch信号激活增强CSCs样特征性和化疗耐药性。    

图6TM和2-DG预处理的癌症细胞的RNA-seq和GSEA

6.通过补充GlcN和Man可部分恢复在HA过量产生的癌细胞中的N-聚糖组装，抑制CSCs样特性并增强顺铂的治疗效果    

HA-high Has2细胞中N-聚糖组成改变的原因可能是核苷酸糖库的减少。为了验证这种可能性，作者在Has2细胞暴露于外源性GlcN（氨基葡萄糖）或Man （甘露糖）24小h后分析细胞的核苷酸糖库水平。结果显示补充GlcN显著增加了细胞UDP-GlcNAc库。当Has2细胞暴露于高浓度外源性Man时，UDP-Glc、UDP-GlcUA和GDP-Man的细胞水平均显著升高（图7A-B）。作者的研究还发现联合补充GlcN和Man可以通过适当处理N-聚糖组装来解决每种核苷酸糖的不平衡积累。总之作者的研究结果表明补充GlcN和Man可以部分恢复ha的癌细胞中的n-聚糖组装。

作者提出是否能通过补充GlcN和Man恢复N-聚糖的组装，从而抑制HA过量产生的癌细胞的CSC样特性。首先通过测量Has2细胞暴露于外源性GlcN或Man后CD44/CD24CSC样细胞的数量。结果显示用GlcN或Man处理以时间依赖的方式减少了CD44/CD24CSC类细胞的数量，且联合补充GlcN和Man对减少CSC样细胞的数量有更大的作用，并减少了乳腺球的大小（图7E-F）。作者最后探究了用这两种己糖处理是否也会影响肿瘤生长。将暴露于GlcN和Man的Has2细胞通过皮下注射到免疫缺陷小鼠中，发现GlcN和Man的联合治疗可显著抑制肿瘤生长，并进一步增强顺铂的治疗效果（图7G-I）。    

图7GlcN和Man的补充抑制CSC样特性并增强顺铂的治疗效果。

文章小结

综上，本研究探索了透明质酸（HA）生物合成调控癌症干细胞（CSCs）代谢可能的作用分子机制。研究强调了蛋白质N-糖基化在整合代谢传感和CSCs信号通路中的重要作用。通过多组学方法成功鉴定了暴露于轻度糖代谢应激的癌症细胞中常见的糖基形式特征，并阐明了改变的N-糖基化通过激活Notch信号通路促进CSC样特性和化疗耐药性的机制。研究还表明通过联合补充氨基葡萄糖（GlcN）和甘露糖（Man）来恢复N-聚糖组装可显著降低CSC样特性，并促进顺铂诱导的肿瘤抑制。综上，这种基于代谢的癌症治疗可能是减少耐药CSCs群体的一种新策略。这篇文章通过整合多组学数据集全面了解CSCs调控的分子机制，并通过体内、体外实验进行验证。近年来，糖基化研究在基础科学的深化以及其在临床医学中应用的拓展，都预示着这一领域将持续保持其科研和应用上的热度。所以各位科研小伙伴再不行动，你就要错过这个村的“热点”了！别犹豫了，扫描二维码联系小薇师姐。小薇师姐真正掌握国自然课题设计的核心要点、课题思路的设计，还有唾手可得的生信分析，绝对会让你的科研一帆风顺~~