植物自带暖宝宝？转录组+代谢组解析神秘植物的发热机制

臭菘（Symplocarpus renifolius），天南星科臭菘属植物，分布于东北黑龙江、松花江和乌苏里江流域，俄罗斯西伯利亚鄂霍次克、日本中部至北部等地。臭菘是一种冰天雪地也能开花的神奇之物，这得益于它的自带暖宝宝体质。臭菘花序（佛焰苞）具有强烈的热发生能力，即使在环境温度降至冰点以下时，也能将其温度调节在大约23°C左右。但是目前臭菘在发育过程中控制热发生和体温调节的机制仍不清楚。近日，日本岩手大学在Plant Physiology上发表题为“Gene expression and metabolite levels converge in the  thermogenic spadix of skunk cabbage”的研究论文。研究者对臭菘佛焰苞发育的3个阶段进行了全面的转录组和代谢组分析，揭示了臭菘自发热机制。

1.臭菘的产热表型分析

前期的测量中作者发现，热发生强度随着臭菘佛焰苞的发育而变化。可以分为三个阶段，“Pre”（热发生前期）、“Hot”（热发生期）和“Post”（热发生后期）（图1B和C）。热发生阶段，佛焰苞的温度峰值约为23°C，与周围空气温度相比有近15°C的差异（图1B）。

 图1 臭菘的产热分析

2. 基因表达谱

作者对热发生前期（Pre）、热发生期（Hot）和热发生后期（Post）的小花和髓进行了转录组分析。比较了每个发育阶段，热发生小花与较少热发生的髓组织中的基因表达谱。层次聚类和热图分析揭示了DEGs的独特聚类，这些聚类的特征是在不同的热发生阶段和组织类型中具有独特的表达模式。23个分类可以明确分为对应小花组织的A群，和对应髓组织的B群。对差异基因进行GO富集分析，在细胞组分类别中，与草酰乙酸脱氢酶复合体和三羧酸（TCA）循环酶复合体相关的基因始终在所有阶段的小花中发现。在分子功能类别中，与氧化还原酶活性相关的基因是热发生小花中最密集表达的基因。

图2 臭菘转录组分析

3. 小花和髓的基因表达谱

对转录组数据进行Kmeans分析，可以分为25类。将其重新分类为6个不同的组。每个组对应于小花（图3B）和髓（图3C）的独特热发生状态。每个组中代表性基因的列表详细说明了它们的产物在小花和髓的每个热发生阶段的特定功能（图3D和E）。

图3 花序发育过程中的动态基因表达模式

4. 产热过程中10个高表达基因的识别

从转录组数据中筛选了小花和髓中高表达的10个基因，包括它们在佛焰苞热发生前期、热发生期和热发生后期的表达。小花中，编码硒结合蛋白1（SBP1）的基因表现出最高的表达水平，其次是编码反式白藜芦醇二甲基转移酶（ROMT）的基因。编码线粒体解偶联蛋白4/线粒体二羧酸转运蛋白2的基因在热发生小花中的表达水平排名第五，而AOX基因排名第九。值得注意的是，在热发生小花中表达量前10的基因中，有4个与糖酵解途径相关，包括磷酸果糖激酶激酶（PFK）、烯醇酶、醛缩酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC），以及是TCA循环一部分的顺乌头酸酶。SBP1、ROMT和AOX这些前10基因中的转录水平通过qPCR做了验证。相比之下，在热发生佛焰苞的髓中，类防御素蛋白P322表现出最高的表达，其次是热休克蛋白1、过氧化物酶42和类似金属硫蛋白的蛋白3（图4B）。

图4 小花和髓中前10的高表达基因

5. 代谢组分析

使用与转录组相同样本进行代谢组检测，以识别93种代谢物在组织和发育阶段的积累情况。代谢物PCA分析发现，热发生阶段和组织差异的样本具有非常清晰的分离。研究者还进行了层次聚类分析（HCA），这进一步确认了PCA的结果，研究中特别关注了核苷酸的积累，包括AMP和腺苷，这些在热发生小花中显著积累。此外，研究还发现了一系列在小花中显著上调的代谢物，包括2-氧戊二酸（2OG）、鸟苷三磷酸（GTP）、胞苷二磷酸（CDP）、半胱氨酸（Cys）、4-羟脯氨酸（4Hyp）和葡萄糖醛酸，这些代谢物的积累在小花中比髓组织高出两倍以上。这些结果表明，与小花热发生阶段相关的多种AMP产生相关基因可能参与其中（图5）。

图5 不同发热阶段小花和髓的代谢组检测

图6 佛焰苞中腺苷酸（AMP）的积累和AMP合成相关基因的变化

5.佛焰苞的热发生阶段的转录组和代谢组整合分析

在对臭菘的佛焰苞进行的研究中，研究者通过比较同一热发生佛焰苞中小花和髓的基因表达和代谢物积累，揭示了热发生过程中的关键分子变化。在热发生小花中，糖酵解、TCA循环和电子传递途径的基因表达增加。涉及ATP依赖的6-磷酸果糖激酶（PFK）和果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）的无功循环可能在热发生中起作用。热发生小花中AMP水平显著增加，伴随着天冬氨酸合成酶和腺苷酸激酶等AMP产生途径的表达上调。SBP1可能作为硒结合蛋白或甲硫醇氧化酶（MTO），在热发生中发挥作用。热发生小花中蛋氨酸代谢途径的基因表达增加，可能导致甲硫醇的产生，这是MTO的底物。研究假设SBP1/MTO在热发生小花中发挥作用，可能会增加硫化氢的浓度，并影响线粒体呼吸（图7）。这些发现为理解佛焰苞如何在不同环境条件下调节其内部温度提供了分子层面的见解，并可能有助于揭示热发生和体温调节的潜在代谢途径。

图7 产热小花转录组与代谢组关联分析

6.硫化氢浓度及其对产热小花线粒体呼吸的影响

SBP1/MTO在热发生佛焰苞的小花中特异性表达。我们假设SBP1/MTO在硫化氢的生产中发挥作用，硫化氢是MTO催化的副产品。为了验证这一假设，我们比较了热发生阶段佛焰苞中小花和髓组织的硫化氢浓度。与髓组织相比，热发生阶段的小花组织中硫化氢浓度显著升高。WB实验发现，小花中观察到SBP1/MTO蛋白的显著积累。通过纯化蛋白后的LC-MS/MS检测确认了小花中SBP1/MTO的存在。实验发现，硫化氢对COX介导的呼吸有显著抑制作用，而对AOX介导的呼吸影响较小。在较低温度和较高硫化氢浓度下，线粒体呼吸可能转向AOX介导的呼吸。研究还观察到热发生过程中特定代谢物的积累变化，这些变化可能与热发生过程中的能量代谢和呼吸作用有关。

图8 硫化氢对生热小花线粒体末端氧化酶呼吸能力的影响

7.产热小花过氧化氢清除与一碳代谢变化

考虑到过氧化氢与硫化氢一起是MTO的产物之一，研究者探索了与过氧化氢清除相关的基因的表达谱。小花中，与髓相比，与过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶相关的基因表达更高。前述分析揭示了SBP1/MTO的转录本与AOX共表达。AOX作为一种同源二聚体，其还原形式是活跃的，而氧化形式是不活跃的。进一步调查了与谷胱甘肽代谢相关的基因表达，这涉及到AOX蛋白的还原。数据表明，在热发生小花中，不仅L-抗坏血酸过氧化物酶（APX）的表达上调，而且谷胱甘肽代谢相关酶的基因，包括谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽水解酶的表达也上调。因为甲醛也是MTO活性的产物，因此后续关注C1代谢。转录组和代谢组分析揭示了C1代谢的协调激活，这表明SBP1/MTO产生的甲醛被有效地重复使用。特别是，转录组分析表明，产热小花中甲酸脱氢酶的转录本显著增加。甲酸进一步被用于C1代谢，促进丝氨酸和脱氧胸苷单磷酸的合成，这是核苷酸代谢的必需成分，突出了这些代谢途径在产热小花中的相互联系。

为了阐明臭菘在发育过程中控制热发生和体温调节的机制，作者对佛焰苞发育的3个阶段进行了转录组和代谢组分析。RNA测序分析揭示了表达基因的不同群体，其中硒结合蛋白1/甲硫醇氧化酶（SBP1/MTO）在热发生花药中表现出最高水平。值得注意的是，从热发生前期到热发生期，花药中替代氧化酶（AOX）的表达始终很高。代谢组分析显示，核苷酸水平的变化与臭菘发育控制和组织特异性的热发生相对应，这在热发生花药中AMP水平的大幅增加中表现得尤为明显。研究还揭示了SBP1/MTO的产物硫化氢抑制了细胞色素c氧化酶（COX）介导的线粒体呼吸，而AOX介导的呼吸相对不受影响。具体来说，在较低的温度下，硫化氢对COX介导呼吸的抑制作用增加，促进了AOX介导呼吸的优势。最后，尽管在佛焰苞发育过程中基因和代谢物的调控不同，作者在热发生期间观察到基因表达和代谢物积累模式的汇聚。这种同步可能在发育调控的热发生中起着关键作用。此外，佛焰苞在热发生阶段的这种汇聚可能为臭菘的体温调节提供了坚实的分子基础。