国自然“C位”：巨噬细胞功能及调控机制、分类、研究方法、应用&文献解读

作者：科研根号三发布时间：2024-09-19

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巨噬细胞作为机体免疫系统中的重要组成部分，在免疫应答、炎症反应、疾病治疗等方面具有广泛的应用和研究前景。因此，巨噬细胞的性质、功能、调控机制以及与其他细胞的相互作用等方面都成为研究的热点。

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一、什么是巨噬细胞？

1）巨噬细胞的发现

巨噬细胞（macrophage，mφ）由Elia Metchnikoff在1882年首次在海星幼体中发现的先天免疫细胞。基于对吞噬作用的解释，揭开了先天免疫系统的神秘面纱，Elia Metchnikoff和Paul Ehrlich一起获得1908年诺贝尔奖(生理学和医学奖)。

2）巨噬细胞的来源、活化

巨噬细胞来源于骨髓中的单核细胞，这些单核细胞在进入血液循环后，迁移到各种组织中成为组织驻留的巨噬细胞。

巨噬细胞通常由胚胎祖细胞产生，包括来自卵黄囊巨噬细胞的输入，独立于血液的单核细胞，以及来自骨髓的成年单核细胞。巨噬细胞的免疫调节、功能可塑性和表型变化主要集中在细胞因子、转录和表观遗传偏差。

巨噬细胞具有高度异质性，例如骨髓中的巨噬细胞叫破骨细胞（Osteoclast）、中枢神经系统中的巨噬细胞叫小胶质细胞（Microglial cell）、肺脏中的巨噬细胞叫肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophage）、肝脏中的叫枯否细胞（Kupffer cell）、结缔组织（Connective tissue）中的叫组织细胞以及脾脏中的叫白髓巨噬细胞、红髓巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、嗜金属巨噬细胞等。

▲常见的巨噬细胞类型

补充：TAM

巨噬细胞不仅仅出现在正常组织中，肿瘤相关巨噬细胞被称为TAM ( Tumor-associated Macrophages ) 。TAM是外周血单核细胞浸润到实体肿瘤组织中演变成巨噬细胞，能够表达CD11b，GR-1等。在已成熟肿瘤中，TAM刺激肿瘤迁移，并能促进肿瘤血管生成。

巨噬细胞的表型及功能随着肿瘤进展的不同阶段而变化，具有双重作用：在肿瘤早期，巨噬细胞起到促进炎症反应及免疫监视作用，同时呈递肿瘤相关抗原，并具有直接抗肿瘤的细胞毒性效应，从而抑制肿瘤的发展。在肿瘤的进展期，肿瘤微环境发生了改变，其中的巨噬细胞能够促进血管生成，抑制T细胞及NK细胞活性，从而抑制免疫系统抗肿瘤效应。

根据统计，超过80%的研究显示巨噬细胞的密度和病患的预后不良相关，由于不同癌症中的TAM分泌的细胞因子以及激活TAM的细胞因子都不尽相同，因此目前认为其中起作用的是巨噬细胞相关细胞因子。在乳癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝细胞癌和结直肠癌预后不良病例中，主要调节巨噬细胞的CSF-1出现过表达；CCL-2则在众多癌症中过表达，也与乳癌、结直肠癌和甲状腺癌的不良预后相关。

帮助肿瘤生长的方向大致有几种：炎症反应、免疫调节、血管生成、血管浸润、肿瘤细胞侵袭等。比如：上调MMP和EGFR等受体表达，破坏基底膜、溶解细胞外基质，可以促进肿瘤迁移和侵袭；通过激活PDL1-PD1和CD47-SIPRα的信号通路来抑制T细胞的作用，导致其失活及组织异构；促进VEGF等因子分泌，可以促进淋巴管生成和肿瘤生长。因此控制TAM相关细胞因子或信号通路，也是治疗癌症的一种策略。

3）巨噬细胞的功能和调控机制

① 巨噬细胞的功能

吞噬作用：

巨噬细胞能够识别和吞噬细胞碎片、病原体等异物，从而清除体内的有害物质。这是巨噬细胞最基本的功能之一。

抗原提呈：

巨噬细胞能够将吞噬的病原体或细胞碎片进行加工处理，将抗原提呈给T淋巴细胞，从而引发特异性免疫应答。

细胞因子分泌：

巨噬细胞能够分泌多种细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）等，参与机体的免疫调节和炎症反应。

② 巨噬细胞的调控机制

分化调控：

巨噬细胞的分化受到多种因素的调控，如集落刺激因子（CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。这些因子能够促进巨噬细胞的分化和发育。

激活调控：

巨噬细胞的激活受到多种因素的调控，如病原体、细胞因子等。激活后的巨噬细胞会表现出更强的吞噬作用、抗原提呈能力和细胞因子分泌能力。

功能调控：

巨噬细胞的功能受到多种因素的调控，如炎症介质、受体信号通路等。这些因素可以影响巨噬细胞的吞噬作用、抗原提呈和细胞因子分泌等功能。

③ 巨噬细胞与其他免疫细胞之间的相互作用

巨噬细胞与其他免疫细胞之间存在着密切的相互作用。例如，巨噬细胞可以与T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）等进行相互作用，共同参与机体的免疫应答和炎症反应。

④ 信号传导通路

巨噬细胞的功能和调控机制涉及到多种信号传导通路，如Janus激酶-信号转导与转录激活子（JAK-STAT）通路、核因子κB（NF-κB）通路等。这些通路在巨噬细胞的激活、分化和功能调控中发挥着重要的作用。

4）巨噬细胞是吞噬细胞

巨噬细胞是除粒细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）和树突状细胞（DC）之外的三种吞噬细胞类型之一。

微生物一旦进入宿主并开始复制，这些吞噬细胞中的一种就会将其识别并吞噬破坏，这一过程称为吞噬作用。大多数病原体通过呼吸系统、肠粘膜、皮肤损伤或泌尿生殖道进入宿主。由于巨噬细胞聚集在粘膜下层组织中，它们通常是第一个遇到病原体的防御细胞。当某些吞噬细胞受体（通常是病原体特有的碳水化合物或脂质结构）与病原体表面相互作用时，吞噬作用就开始了。

在第一次相互作用后，吞噬细胞质膜将病原体包围并内化在一个被称为吞噬体的大膜包裹的内吞囊泡中。然后吞噬体与一个或多个溶酶体融合，形成吞噬溶酶体，溶酶体是含有抗菌肽和酶的小囊泡。溶酶体内容物被释放到吞噬溶酶体中，吞噬溶酶体反过来经历酸化和酶促过程，生成高活性的一氧化氮和超氧化物自由基来杀死病原体。

关于吞噬细胞受体的两个例子是Dectin-1和甘露糖受体(CD206)。两者都是C型凝集素样家族的成员。Dectin-1由巨噬细胞和中性粒细胞表达，并与真菌细胞壁中常见的葡萄糖聚合物结合。CD206由巨噬细胞和DC表达，并与真菌、细菌和病毒共有的多种甘露糖基化配体结合。

▲第一组：组织巨噬细胞携带多种表面受体，其中一些是吞噬作用所必需的。甘露糖受体可识别细菌、真菌和病毒上的甘露糖基化配体。Dectin-1与真菌细胞壁上的某些葡萄糖聚合物结合。补体受体结合并内化补体包裹的细菌。大多数吞噬作用受体可识别病原体特异性的碳水化合物或脂质结构。

▲第二组：吞噬作用发生后，吞噬体与一个或多个溶酶体融合，生成吞噬溶酶体。

二、巨噬细胞的分类

巨噬细胞的分类仍然是一个非常有争议的话题，不同的因素会导致不同的表型和巨噬细胞活化状态，包括信号分子、生长因子、转录因子、表观遗传和转录后机制和变化，以及小生境信号，如细胞因子、细胞间接触物和代谢物。

此外，面对微生物及其产物，如脂多糖（LPS），巨噬细胞可以调节自身的活化状态。然而，巨噬细胞的活化在组织稳态以及炎症和疾病进展中起着至关重要的作用。

一般来说，巨噬细胞可以根据其功能和活化作用进行分类，并分为2种亚型：

经典活化的M1巨噬细胞：它们是促炎细胞，并被 LPS单独或与Th1细胞因子(如IFN-γ，GM-CSF)联合极化，并产生促炎细胞因子，如白细胞介素-1β (IL-1β)， IL-6, IL-12, IL-23和TNF-α；

替代活化的M2巨噬细胞：具有抗炎和免疫调节作用，被Th2细胞因子IL-4和IL-13极化，产生IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子。

▲M1和M2巨噬细胞的分化。M1和M2巨噬细胞响应多种因素，包括信号分子、生长因子、转录因子、细胞因子、细胞间接触物和代谢物。

1）典型活化态的M1巨噬细胞

M1巨噬细胞主要通过天然和适应性免疫反应在Th1细胞募集、病原体抵抗和肿瘤控制中发挥作用。

M1巨噬细胞通常由病原体、LPS、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和1型辅助性T （Th1）细胞因子干扰素γ（IFN-γ）活化。许多通路能促进巨噬细胞向M1极化，包括IRF/STAT、LPS/TLR4和NF-κB/PI-3激酶通路。

从特征上说，M1巨噬细胞抗原呈递活性强和分泌促炎细胞因子多，如白细胞介素1 （IL-1）、IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）。此外，它们下调IL-12和IL-23和IL-10的表达。M1巨噬细胞的刺激导致 IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌水平提高。此外，M1巨噬细胞表型表达高水平的主要组织相容性复合体II类（MHC II）、CD68、CD80和CD86，以及针对Th1细胞的趋化因子，包括CXCL9和CXCL12。

2）替代活化型M2巨噬细胞

M2巨噬细胞可由寄生虫或真菌感染、免疫复合物、凋亡细胞、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型辅助性T细胞因子（Th2）IL-4、IL-33和IL-25通过Th2细胞替代活化。促进巨噬细胞进入M2状态的潜在信号包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ 。

与经典活化亚型相反，替代活化的亚型表达相反的表达谱：下调IL-12和IL-23，上调IL-10和IL-1RA。此外，M2巨噬细胞表达较低的炎症细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬细胞在病原体清除、抗炎反应和代谢以及伤口愈合、组织重塑、免疫调节、肿瘤进展和恶性肿瘤中发挥作用。

M2表型的特点是表达CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般来说，这种亚型高效表达吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受体，以及能通过精氨酸酶通路增加鸟氨酸和多聚氨基酸的产生。这种类型的巨噬细胞表达的趋化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24 。

补充：M2巨噬细胞亚型

针对巨噬细胞不同的刺激，已知有四种M2亚型：M2a、M2b、M2c和M2d。这些亚型因其细胞表面标志物、分泌的细胞因子和生物功能不同而各不相同。然而，所有M2巨噬细胞亚型都共同表达IL-10。

M2a巨噬细胞：由IL-4或IL-13活化。IL-4反过来促进甘露糖受体（CD206）的表达。经证实，进一步上调 IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18和CCL22能促进细胞生长、组织修复和胞吞作用。

M2b巨噬细胞：由免疫复合物、Toll样受体（TLR）配体和IL-1b活化。活化后，这种亚型释放促炎和抗炎细胞因子TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-10。M2b巨噬细胞在免疫反应和炎症的调节中发挥作用。

M2c巨噬细胞：由糖皮质激素、IL-10和TGF-b（和灭活的巨噬细胞）活化。这种亚型的特征是高效表达抗炎IL-10、促纤维化因子TGF-b、CCL16、CCL18以及Mer受体酪氨酸激酶（MerTK），其中MerTK能促进凋亡细胞吞噬。

M2d巨噬细胞：由TLR拮抗剂、IL-6和腺苷活化。腺苷促进IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，这个过程能加剧血管生成和肿瘤进展。

更多巨噬细胞激活和极化、M1/M2巨噬细胞代谢信号通路和免疫调节内容可点击查看：文献解读 | 巨噬细胞在免疫调节和治疗中的作用探索

3）其他类型的巨噬细胞

另外还有一些其他类型的巨噬细胞，也就是混合型巨噬细胞，例如：M4型巨噬细胞（趋化因子刺激）；Mox型巨噬细胞（氧化磷脂刺激）；M(Hb)型巨噬细胞（血红蛋白刺激），它们主要发挥低促炎和低吞噬作用。

三、巨噬细胞的研究方法

可以从全血（PBMC分离、巨噬细胞分析、单核细胞分化成巨噬细胞）或组织或肿瘤（组织或肿瘤样本的单细胞悬液制剂）中分离和分析巨噬细胞。此外，人和小鼠单核细胞系有商业化的产品，包括THP-1细胞（急性单核细胞白血病）、U937细胞（组织细胞淋巴瘤）以及RAW264.7细胞（小鼠白血病单核巨噬细胞）和J774A.1细胞（小鼠BALB/c单核巨噬细胞）。

有多种方法可以分离巨噬细胞，包括磁珠细胞分选、密度梯度分离、激光捕获显微解剖和流式细胞仪分选法（FACS）。分离后，可以通过基因表达分析、功能研究、细胞因子和趋化因子生成的评估以及使用免疫荧光染色、免疫检定、流式细胞仪、免疫印迹或聚合酶链反应的蛋白质表达和细胞表面标志物来分析和表征巨噬细胞功能和表型（并非每种分析方法均需要分离巨噬细胞）。

1）体外培养

单核细胞来源的巨噬细胞 (MDM)：

通过从外周血中分离单个核细胞，并通过特定诱导因子如M-CSF或GM-CSF诱导分化成巨噬细胞。这些巨噬细胞常用于研究巨噬细胞的生物学特性和功能。

细胞系：

如使用RAW 264.7（小鼠）和THP-1（人类）等细胞系，这些细胞系可以通过刺激剂如Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)诱导分化成巨噬细胞样细胞，便于进行实验操作和研究。

2）流式细胞术

表型分析：

利用流式细胞术检测巨噬细胞表面的特定标记物，如CD11b、CD14、CD68等，以鉴定和分类巨噬细胞。

功能性测试：

评估巨噬细胞的吞噬能力、产生氧化物的能力等，这些功能是巨噬细胞发挥免疫作用的关键。

3）免疫组化&免疫荧光

定位和表达分析：

在组织切片上使用针对巨噬细胞的特异性抗体，以检测巨噬细胞的存在和激活状态，通常使用显微镜观察染色结果。

共定位研究：

通过免疫组化和免疫荧光技术观察巨噬细胞与其他细胞类型或标记物的空间关系，有助于了解巨噬细胞在组织中的作用和相互作用。

4）基因表达分析

RNA测序：

分析巨噬细胞在不同条件下的全基因表达谱变化。

5）蛋白质组学分析

质谱分析：

研究蛋白质表达、修饰以及蛋白质-蛋白质相互作用。

6）遗传操纵

基因敲除/敲低：

使用CRISPR/Cas9、shRNA等技术干扰巨噬细胞中特定基因的表达。

过表达系统：

通过转染相关载体增加特定蛋白的表达。

7）动物模型

感染模型：

研究巨噬细胞在病原体感染中的作用。

疾病模型：

利用转基因或基因敲除动物模型研究巨噬细胞在炎症、肿瘤等疾病中的功能。

8）生物信息学

数据分析：

利用各种算法和数据库分析高通量基因表达、蛋白质组学数据。

四、在免疫和炎症过程中的作用

1）巨噬细胞在免疫调节中的作用

免疫抑制：巨噬细胞能够分泌免疫抑制性因子，如IL-10、TGF-β等，以抑制过度的免疫反应，维持免疫稳态。此外，巨噬细胞还能够表达PD-L1等分子，与T细胞上的PD-1结合，从而抑制T细胞的活化，实现免疫抑制。

免疫促进：巨噬细胞在受到适当的刺激后，能够分泌促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β等，以及趋化因子，促进其他免疫细胞的招募和活化，从而增强免疫反应。

研究思路：通过基因敲除或基因敲入技术，研究特定细胞因子或受体在巨噬细胞免疫调节中的作用，以及通过流式细胞术等方法分析巨噬细胞与其他免疫细胞的相互作用。

2）巨噬细胞在抗肿瘤免疫中的作用

抗原提呈：巨噬细胞能够摄取、处理和呈递肿瘤细胞抗原给T细胞，从而激活特异性抗肿瘤免疫反应。

坏死肿瘤细胞：活化的巨噬细胞可通过释放溶解细胞酶、穿孔素、颗粒酶等直接坏死肿瘤细胞。此外，巨噬细胞还能分泌TNF-α等细胞毒性因子间接坏死肿瘤细胞。

研究思路：利用肿瘤模型和基因编辑技术，研究巨噬细胞在抗肿瘤免疫反应中的关键作用，以及通过优化巨噬细胞的功能来提高抗肿瘤免疫治疗效果。

3）巨噬细胞对病原微生物和炎症介质的吞噬和清除能力：

巨噬细胞通过伸出伪足包围并摄入病原微生物、炎症介质等异物颗粒，形成吞噬体或吞隐小泡。这些吞噬体与初级溶酶体融合形成次级溶酶体，被溶酶体酶消化分解，从而实现对病原微生物和炎症介质的清除。

研究思路：利用荧光标记的病原微生物或炎症介质，观察巨噬细胞在体外的吞噬过程，并通过流式细胞术等方法定量分析巨噬细胞的吞噬能力。同时，研究影响巨噬细胞吞噬功能的因素，如病原微生物的表面结构、炎症介质的种类和浓度等。

五、巨噬细胞高分文献解读

文献1

▲DOI: 10.1016/j.immuni.2023.01.011，IF=32.4

主要内容：体外研究表明氧化磷酸化(OXPHOS)与抗炎巨噬细胞有关，而促炎巨噬细胞依赖于糖酵解。然而，巨噬细胞在组织中的代谢需要(TMFs)来完成其稳态活动尚不完全清楚。作者通过分析人类和小鼠的RNA-seq数据，发现OXPHOS是来自不同器官的TMFs在稳态中最高的识别过程。通过Tfam缺失损害TMF中的OXPHOS对TMF群体有差异影响。由于脂质处理能力受损，Tfam缺失导致肺泡巨噬细胞(AMs)减少，导致胆固醇含量增加和细胞应激，导致体内细胞周期停滞。在肥胖中，Tfam消耗选择性地消融促炎脂质处理白色脂肪组织巨噬细胞(WAT-MFs)，从而预防胰岛素抵抗和肝成骨病。因此，区分TMF群体的是OXPHOS，而不是糖酵解，它对于维持具有高脂处理活性的TMF至关重要，包括促炎的WAT-MFs。这可能提供一种选择性的靶向治疗工具。

文献2

▲DOI: 10.1038/s41590-023-01430-3，IF=30.5

主要内容：暴露于脂多糖会触发巨噬细胞促炎极化，并伴有代谢重编程，其特征是有氧糖酵解升高和三羧酸循环中断。然而，与脂多糖不同，CD40信号能够通过一些尚未定义的代谢程序驱动促炎和抗肿瘤极化。本研究表明，CD40激活可触发脂肪酸氧化(FAO)和谷氨酰胺代谢，从而促进巨噬细胞中ATP柠檬酸裂解酶依赖性促炎基因的表观遗传重编程和抗肿瘤表型。从机制上讲，谷氨酰胺的使用通过谷氨酰胺-乳酸转化微调NAD/NADH比例，从而加强了FAO诱导的促炎和抗肿瘤激活。基因消融参与CD40介导的代谢重编程的重要代谢酶可消除抗CD40诱导的激动性抗肿瘤反应和肿瘤相关巨噬细胞的再教育。总之，这些数据表明，代谢重编程，包括FAO和谷氨酰胺代谢，控制促炎和抗肿瘤极化的激活，并强调了在激动性抗CD40治疗之前对肿瘤相关巨噬细胞进行代谢预处理的治疗潜力。

文献3

▲DOI: 10.1038/s41423-022-00961-3，IF=24.1

主要内容：在脓毒症中，巨噬细胞的吞噬功能受损，但其机制尚不清楚。细胞外冷诱导RNA结合蛋白(eCIRP)是一种引起炎症的损伤相关分子模式。然而，eCIRP是否调节巨噬细胞细菌吞噬尚不清楚。本研究报道了CIRP-/-小鼠和抗eCIRP抗体治疗的小鼠在脓毒症后血液和腹膜液中的细菌负荷降低。在脓毒症小鼠中，eCIRP水平升高与细菌清除率降低相关。CIRP-/-小鼠在脓毒症后的存活率明显增加。重组小鼠CIRP (rmCIRP)在体内和体外均能显著降低巨噬细胞对细菌的吞噬作用。rmCIRP降低巨噬细胞中肌动蛋白结合蛋白、ARP2和p-cofilin的蛋白表达。rmCIRP显著下调Rac1激活因子βPIX的蛋白表达。进一步证明，STAT3和βPIX在rmCIRP处理后形成复合物，阻止βPIX激活Rac1。作者还发现，eCIRP诱导的STAT3磷酸化是eCIRP在肌动蛋白重塑中的作用所必需的。抑制STAT3磷酸化可阻止STAT3-βPIX复合物的形成，恢复rmCIRP处理巨噬细胞中ARP2和p-cofilin的表达和膜突起。STAT3抑制剂stattic可恢复rmCIRP诱导的巨噬细胞吞噬功能障碍。因此，作者确定了eCIRP引起巨噬细胞吞噬功能障碍的新机制，为改善脓毒症提供了新的治疗靶点。