七千字实验方案 | 单细胞悬液制备全流程

作者：科研根号三发布时间：2024-09-06

宝子们，生科人实验互帮互助微信群建好了！WB、流式细胞术、PCR、免疫组化/荧光、Elisa...，加我拉你进群！

一、摘要

原代组织是目前生物医学相关科研领域重要的样本来源，对其需进行细胞外基质降解和单细胞分离，包括组织解剖、机械解离和酶消化三个重要步骤，并希望得到更高的回收率和活力，以应用于后续的流式或单细胞测序等分析。

1>>制备单细胞悬浮液的要求

1）快速

2）高活力

3）最少细胞碎片或聚集体

4）最大程度保持细胞表面抗原不被破坏

2>>制备单细胞悬浮液的基本步骤包括

A.切碎增加起始固体组织材料的表面积，以使组织和消化酶之间的接触最大化

B.通过酶来消化细胞外基质

C.切割细胞 - 细胞连接

二、组织的组成

一个完整的组织包括胞外基质，细胞和细胞膜表面的连接物将细胞和细胞之间互相铆定。

1>>细胞外基质

在整个生物体中，所有组织和器官都由被称为细胞外基质的非细胞成分包围的细胞组成。细胞外基质的功能是为组织提供支架和结构支持，同时还在每个特定组织内启动生物化学和生物力学提示。细胞外基质由属于三大类生物分子的成分组成：胶原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白。

1）胶原蛋白是细胞外基质中最丰富的纤维蛋白。因此，胶原蛋白是该基质的主要结构元素，提供拉伸强度和调节细胞粘附。胶原蛋白还通过支持趋化性和迁移同时指导组织发育来响应细胞外基质中的生化信号。

2）蛋白多糖是由与糖胺聚糖链结合的以蛋白质为核心组成的生物分子。蛋白多糖在细胞外基质中的作用包括组织基质组装，调节组织中细胞因子和生长因子的信号传导，以及激活细胞表面受体以影响细胞和整个器官的功能和发育。在组织中发现的常见类型的蛋白多糖包括核心蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖和透明质酸。核心蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖存在于整个生物体的所有组织中。在大多数组织中发现透明质酸作为结构组分和信号分子，但缺乏通常指示蛋白多糖的蛋白质核心。许多其他类型的蛋白聚糖仅存在于整个生物体的特定组织类型中，本文不再进行评述。

3）糖蛋白是由与碳水化合物基团连接的多肽链组成的任何蛋白质。在细胞外基质中发现的一种常见糖蛋白是纤连蛋白，其通过与胶原蛋白，血小板反应蛋白，整联蛋白，纤维蛋白和糖胺聚糖结合而发挥结构作用。通过积极调节相关细胞在粘附，分化，迁移，表型稳定性和细胞凋亡抗性方面的行为，层粘连蛋白也有助于细胞外基质的结构。弹性蛋白是组织细胞外基质中弹性纤维的主要成分，是这些纤维弹性的主要贡献者。弹性蛋白通常存在于皮肤，肺，韧带，肌腱和血管组织中。通常在细胞外基质中发现的其他糖蛋白包括纤维蛋白原，原纤蛋白，纤维蛋白，肌腱蛋白，血小板反应蛋白和软骨寡聚复合蛋白。

2>>细胞膜

细胞膜是磷脂双层，其作为围绕细胞的疏水屏障，保护细胞内部及其细胞器。细胞膜含有各种膜蛋白，这些蛋白在细胞的发育和存活中至关重要。受体蛋白促进信号穿过细胞膜的传递，使细胞能够响应其环境中的线索，而嵌入细胞膜的通道和转运蛋白能够通过主动和被动过程使特定离子进入或离开细胞。

酶蛋白也存在于整个细胞膜中，催化细胞内和细胞周围的化学反应。消化酶的选择和浓度对于从固体组织制备单细胞悬液进行流式分析至关重要，因为细胞表面受体或膜蛋白可被酶（如胰蛋白酶）的蛋白水解活性切割，在免疫表型分析实验中可能导致错误的阴性结果。

3>>细胞 - 细胞连接

细胞 - 细胞连接是组织的主要结构和功能组分，必须将其切割以制备单细胞悬液，用于流式分析。与制备单细胞悬浮液相关的三种主要类型的细胞 - 细胞连接是（i）封闭连接，（ii）连通连接，和（iii）锚定连接。封闭连接，通常称为紧密连接，在内皮细胞和上皮细胞的顶点附近保持连续的周向密封。这些连接点表现为与邻近细胞的细胞膜明显融合的一系列离散位点。紧密连接存在结构变异，由跨膜蛋白组成，包括密蛋白，连接粘附分子家族蛋白，闭合蛋白，粘连蛋白和内皮细胞选择性粘附分子。紧密连接的功能是形成屏障，该屏障可以控制水和溶质在细胞旁空间的运动，同时还保持整个细胞膜中存在的离子通道，泵和载体蛋白的分布。通信连接通常称为间隙连接，其功能是允许相邻细胞之间的代谢物和离子的细胞质交换。这些间隙连接由无脊椎动物中的无脊椎连接蛋白和脊椎动物中的连接蛋白组成，其中六种连接蛋白结合形成一个连接子。锚定连接包括粘附连接，桥粒和半桥粒，其作用是介导相邻细胞之间的细胞粘附并转移细胞内信号。锚定连接由钙粘蛋白组成，形成拉链状结构，使相邻细胞在组织内稳定粘附。

三、组织解离

1>>切碎组织

在从生物体中解剖出固体组织后，在引入消化酶之前，应冲洗组织以清除任何血液或其他不需要的物质。然后将组织切碎并用剪刀，手术刀或刀片分散，以增加总表面积。这增加了酶与组织表面之间的接触，导致更有效和完全的消化，同时缩短了消化所需的时间。

2>>酶

组织将细胞保持在一起，由细胞外基质和细胞 - 细胞连接点支持，这些细胞连接由多种蛋白质和其他生物分子组成，这些分子需要特定的酶来适当消化并从细胞悬浮液中除去。

第一类酶：分解细胞外基质的酶

1）分散酶(Dispase)是从细菌中分离的常用中性蛋白酶，对胶原蛋白IV和纤连蛋白具有高水平的酶特异性。分散酶可用于细胞集落的分离和组织块分解成小块细胞，因为它可以切割细胞和细胞外基质之间的附着物，而不会影响细胞 - 细胞连接。然而，在用分散酶消化组织时应该小心，因为它能够切割特定的相关表面分子或抗原，例如与T细胞分析相关的标记。因此，如果观察到表位缺失，则从消化缓冲液中省略分散可能是有帮助的。

2）胶原酶能够破坏胶原蛋白中存在的肽键，有助于消化细胞外基质，使细胞释放到悬浮液中。重要的是要注意纯化的胶原酶比天然来自细菌的传统胶原酶更有效，因为纯化酶的组成变化较小，增加了整个组织消化过程中细胞的稳定性。
3）透明质酸酶，细胞外基质中的结构蛋白多糖，可被在细菌和脊椎动物生物体中产生的透明质酸酶酶家族降解。这些透明质酸酶切割透明质酸的糖胺聚糖部分中存在的β1,4-糖苷键，有助于细胞外基质的消化。

第二类酶：破坏细胞 - 细胞连接的酶

1）胰蛋白酶是在脊椎动物有机体的消化系统中合成的天然蛋白酶。可用于降解细胞 - 细胞连接中存在的某些蛋白质，但缺点是破坏细胞膜蛋白；也会导致细胞裂解，从而出现游离DNA诱导的细胞聚集。常不用胰蛋白酶制备来自固体组织的单细胞悬液用于流式细胞术实验。

2）木瓜蛋白酶是来自木瓜植物的替代蛋白酶。已知木瓜蛋白酶降解构成细胞间紧密连接的蛋白质。然而，与胰蛋白酶一样，也会导致细胞裂解，从而出现游离DNA诱导的细胞聚集。

第三类酶：脱氧核糖核酸酶（DNase），用于切割DNA骨架的磷酸二酯键
1）DNase的两种主要类型是DNase-1和DNase-II，它们具有略微不同的酶功能。DNase-II不适合制备单细胞悬液，因为它在凋亡中参与吞噬介导的DNA降解途径。2）DNase-I适用于组织消化和单细胞悬浮液的制备，降解由死细胞裂解释放的游离DNA而不引发凋亡，来防止细胞聚集。氯化钙（CaCl2）充当DNase-1的酶活化剂，因此在酶消化过程中被引入消化混合物中。钙离子（Ca2 +）与DNase-I酶紧密结合，以稳定其活性构象，并允许游离DNA的正常降解。

第四类：开发并优化的商品化产品

1）Accutase是一种蛋白酶和胶原酶混合物，模仿胰蛋白酶和胶原酶的作用，但其浓度远低于使用标准酶时所需的浓度。Accutase含有具有蛋白水解，胶原水解和DNase活性的酶的混合物，与使用类似酶的混合物进行组织消化相比，产生更高的总细胞产量和改善的总抗原保存。2）TrypLE是另一种酶混合物，含有纯化的重组酶，模拟胰蛋白酶的活性而不改变细胞表面抗原的表达。该产品避免了胰蛋白酶在组织消化中使用时出现的问题，并且改善细胞存活和更有效的单细胞悬浮液制备。

3>>酶和机械解离

基于所使用的酶混合物，通过将消化混合物引入切碎的固体组织并在特定温度下孵育来进行酶解离。酶可以是温度特异性的，因此在给定温度下以最高速度和效率工作，通常为37℃，也可以在4℃或冰上进行，取决于特定的酶。较低的温度可能会降低酶的反应速度并延长酶解时间，但可以帮助减少细胞死亡。当选择消化混合物用于制备用于流式分析的单细胞悬液时，酶强度和酶浓度是两个最重要的考虑因素。具有高强度或高浓度的酶可能损害细胞上存在的细胞表面标志物，这可能影响这些标志物的可用性和细胞在进一步实验中的活力。因此，应使用温和的酶、短消化时间来分离轻度贴壁细胞如淋巴细胞。确定用于酶促解离的酶的最佳强度和浓度对于细胞的适当分离和组织的成功消化是经验性的和关键的。在整个酶促解离过程中，需机械解离辅助。在轨道振荡器上进行酶消化有助于细胞从细胞外基质释放到悬浮液中。在酶促解离后，应过滤悬浮液以排除未消化的组织块或聚集体。

四、评估单个细胞悬浮液

评估从固体组织获得的单细胞悬浮液的质量是流式细胞术实验之前需采取的重要步骤。评估固体组织的酶促和机械解离后的三个关键参数（i）细胞活力（ii）细胞碎片

（iii）聚集体

使用台盼蓝细胞活力排除测定法可以轻松测定单细胞悬浮液中的细胞活力，其中死细胞将台盼蓝吸收到其细胞质中，而活细胞保留其选择性渗透膜并防止台盼蓝进入细胞质。然后可以使用光学显微镜评估单细胞悬浮液中活细胞和死细胞的相对量。还可以使用光学显微镜快速评估细胞碎片和细胞聚集体。也强烈建议在流式细胞仪上评估单细胞制备质量，核染色DRAQ5将区分完整细胞与细胞碎片，活力染料PI将允许定量死细胞的百分比。

五、去除细胞碎片和死细胞

将组织处理成单细胞悬浮液的过程中，有些细胞会自然死亡或由酶促和机械解离引起的损伤而死亡。高细胞活力应该是每次组织消化的重要目标，可使用商品化试剂盒来去除细胞碎片和死细胞。这些试剂盒可从Miltenyi Biotec Inc.（Auburn，CA）和STEMCELL Technologies Inc.（Cambridge，MA）等供应商处获得，是使用磁珠和特异性结合缓冲液来标记细胞碎片，死细胞或垂死细胞，通过磁分离负选的方式仅保留活细胞。

六、单细胞悬浮液的冷冻保存

涉及功能测定的流式细胞术实验应在制备单细胞悬液后不久或在冷冻保存的活细胞上进行。

1>>应测试冷冻保存对细胞活力和功能的潜在影响

2>>多聚甲醛的温和固定：

a.对一定时间后分析的样品，避免在冷冻保存期间改变抗原的表达或存在。 b.固定可能会改变蛋白质构象影响抗原性，需评估抗体识别是否会改变。 c.固定保持细胞的物理稳定，同时防止新死细胞的碎裂。 d.保留异质细胞群重要的光散射特性，并有助于防止细胞粘在一起或粘在染色时使用的板或管壁上。对脆性/异质性群体如肺单细胞尤其重要。 e.应在固定前对细胞染色如FVS系列的活/死染料，以便在数据分析过程中区分这两种群体。

七、总结影响因素

相关处理过程：

1）与从新鲜组织中分离细胞相比，冷冻组织会降低总细胞回收率。表3中肺组织在解剖后和消化之前在-80℃下储存72小时，显示细胞回收率降低和细胞活力降低。因此，在可能的情况下，从新鲜组织中分离和处理细胞是最佳实践。

2）使用组织匀浆器的强力机械解离不适合制备单细胞悬浮液，因为它反而产生细胞和组织成分的肉汤，可用于分离蛋白质用于其他分析方法。当使用该方法时，细胞活力或完整性遭到破坏，应避免使用组织匀浆器获得单细胞悬浮液。表3中的数据显示使用组织匀浆器代替切碎组织导致细胞产量和活力降低。

3）细胞碎片在离心过程中会因为悬浮在上清液中被吸走丢弃，和实际含量产生有较大偏差，尤其是针对组织匀浆的样本。

4）涡旋细胞是另一种强有力的细胞处理形式，必须避免这种形式以保持单细胞悬浮液的活力并防止细胞崩解。在表3中概述的实验中，涡旋细胞导致细胞活力降低和细胞碎片和聚集物增加。不使用涡旋，优选轻轻吸打以重悬细胞或细胞沉淀，移液吸打时尽量避免气泡的产生。

5）离心是另一个会导致固体组织单细胞悬液制备不良结果的因素。通常，细胞应在300-900相对离心力（RCF）之间离心，900 RCF更适合固定细胞，较低的离心力用于活的未固定细胞。重要的是要注意，这些值以相对离心力而不是每分钟转数（RPM）表示，因为RPM表示取决于每个特定离心机上的转子半径的可变力。以过高的速度离心细胞可导致聚集体的产生和对细胞膜的损伤，而以过低的速度离心将使细胞保持悬浮并在吸出上清液时丢失。

6）表3中，消化不够的处理条件是在消化混合物中孵育20min，显示聚集体和细胞碎片增加；过度消化是孵育5hr，导致细胞活力显着降低以及悬浮液中细胞碎片增加。因此，确定每个实验中涉及的特定消化酶和组织的正确孵育时间至关重要。

7）如果可能，应将未固定的细胞在冰上染色以保持活力并避免在免疫染色过程中细胞死亡。

8）在整个消化过程中，所有缓冲液都应含有DNase-I，以降解裂解细胞释放的游离DNA，防止细胞聚集。

9）乙二胺四乙酸（EDTA）是一种螯合剂，可螯合包括整联蛋白介导的细胞与细胞外基质粘附所必需的那些二价金属离子。因此，在消化混合物中包括EDTA对于限制天然粘附细胞如上皮细胞和巨噬细胞的粘附是重要的。

10）材料选择也在限制粘附方面起作用。由于细胞和聚丙烯表面之间的亲和力较低，聚丙烯管或板最适合于制备单细胞悬浮液，从而减少了细胞粘附到管或板上并从悬浮液中丢失的可能性。聚苯乙烯旨在促进细胞粘附和扩散，在流式细胞仪实验中应避免使用。

11）在尝试获取和分析流式细胞术数据之前，检查细胞活力并评估单细胞悬液的总细胞产量以及细胞碎片和聚集体的清除是非常重要的。为此目的采用核染色（DRAQ5）和细胞活力染色（PI）。

12）如果细胞悬浮液被过量的红细胞污染，应使用红细胞裂解液去除红细胞，并确保悬浮液中保留感兴趣的细胞类型用于免疫染色和流式细胞仪采集。对应的处理流程应应用于实验中的所有样品，以保持细胞制备程序一致。

所有实验均使用年龄和性别匹配的小鼠的左肺叶进行。针对每种条件显示三次实验的平均标准误差。（*）表示与Best Practice相比p <0.05（t-检验）。将聚集物定量为每100nl体积的计数（1平方英寸的血细胞计数器室，0.1mm深度）。回收率的计算为（完整细胞数）/（最佳实践完整细胞数）* 100%。

应用相关注意点：

1.表型分析时，应检验研究关注的抗原是否会被机械和酶解所破坏，因为一些酶可以改变与表型分析相关的一些标志物的表达。2. 对于涉及细胞内细胞因子检测的实验，建议蛋白质转运抑制剂阻断细胞因子的分泌。3.组织解离也已经显示出对RNA表达的影响，部分原因是microRNA的上调，当细胞从其周围组织中分离时，microRNA在限制细胞活性中发挥作用。在评估RNA表达之前，应考虑这种变化，还应在各缓冲液中包括RNase抑制剂以避免感兴趣的RNA转录物的降解。4.流式磷酸化研究旨在通过研究激酶信号通路来测量细胞内蛋白质的磷酸化状态。对于这些研究，磷酸酶抑制剂应包括在酶解混合物中，以保持磷酸化信号并确保准确的结果。5.最后，受损细胞可释放能够切割目的表位的蛋白酶。当添加到消化混合物中时，蛋白酶抑制剂能够减轻这种表位缺失。

附：小鼠肺单细胞悬液制备最佳实践

1. 从C57BL/6小鼠收获肺并从周围组织中分离。

2. 用PBS冲洗肺并用剪刀切碎机械分散，增加酶解面积。

3. 每个肺加入2.5ml消化缓冲液，包含100mg/ml Dispase II（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，Cat＃04942078001），10mg/ml胶原酶A（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，Cat＃10103578001），1500kU/ml DNase I（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Cat＃D5025-150KU）和0.025M CaCl2。

4. 在轨道振荡器上于37℃温育1hr。

5. 使用移液管轻轻混合悬浮液，并进一步温育30min。

6. 40μm过滤器过滤到50ml Falcon管中。

7. 使用Beckman Coulter，Allegra X-12R离心机将悬浮液以900g离心5min，并吸出上清液。

8. 将沉淀重悬浮于UV活/死染料（Invitrogen，Waltham，MA，Cat＃L23105）中，并在室温下避光孵育30min。

9. 将PBS加入悬浮液中，以900g离心5min，吸出上清液。

10.将细胞在含4％多聚甲醛（Polysciences，Warrington，PA，Cat＃18814-10）的PBS中的中固定10min（10ml 16％PFA稀释于30ml PBS中）。

11.直接免疫染色或冷冻保存用于以后的抗体染色。

Reference:

Andrew Reichard,1 Kewal Asosingh1,2* Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry Cytometry Part A 2018

流式细胞术相关内容推荐：

流式行业标杆神器，FlowJo 10 ！（破解版）

流式细胞术实验全流程：实验设计、样本制备、样品染色、流式应用

超全超详细！手把手教会你解读流式细胞数据

干货 | 流式常用的免疫细胞标记物汇总！

流式数据分析 | 平均荧光强度Mean Fluorescence Intensity (MFI)