精准送样指南丨VisiumHD空间转录组研究，将新鲜组织制备成石蜡？

石蜡样本的包埋正常都始于新鲜组织，取得新鲜组织后，将组织于10%中性组织固定液或4%多聚甲醛中固定，然后将组织包埋在石蜡中以便后续的切片和长期的保存。虽然整个过程简述起来相对简单，但实验过程中需要考量的细节要点颇多，如组织固定不得当会导致影响分析物质量、不合适的组织包埋会损坏组织切片，导致无法开展后续的空转实验等。

但考虑到大量的珍贵且广泛的临床样本都是通过石蜡包埋的方式进行处理保存的，所以10x方面也结合了多方考量对包埋处理中可能会出现的不当处理进行了总结，供各位老师参考。

准备阶段

Tips1：摘除组织时应尽量轻柔，避免外部压力导致组织完整度受损从而无法对组织进行适当的固定。外部压力可能会造成：

1、组织缺血 

2、电灼造成的凝固性坏死 

3、手术创伤造成的出血

Tips2：组织切除后优先考虑短时间内进行固定。如果无法第一时间对组织进行固定处理（如出血时间过长或机体死后间隔过长）将样本储存在等渗溶液中。组织切除和固定的时间间隔建议不超过四小时（时间可根据样本自身情况进行调整）。如处理不当，将会造成自溶、组织降解以及其他负面影响。

组织固定

过长或过短的固定时间都会对后续空转实验的性能有着负面的影响。

1 固定时间过短

1. 固定不充分可能会导致某些酶在组织切除后继续作用，从而导致分析物的降解（蛋白、核酸、脂质）。

2. 固定时间不充足会导致组织伪影，如染色质的形态不规则、细胞质伊红染色过度和自溶伪影，如上皮和结缔组织的分离。

2 固定时间过长

1. 过度固定可能会导致某些分子特征的结构完整性丧失、脂质氧化、过度交联以及抗原性降低。

2. 过度固定还可能会因组织硬化而使切片更具挑战性。

3. 过度固定可能会导致组织伪影，如形状不规则细胞、细胞变小或细胞核染色过度。

3 解决方案

在进行固定实验之前，先从以下几个切入点来考虑固定时间。

1. 实验前考虑：物种信息、组织类型、疾病模型。

2. 实验时如何避免固定时间过长或不充分的现象：

• 组织厚度：组织的厚度对于固定液的渗透有着很大的影响。所以对于新鲜采集的组织样本，应使用手术刀对其进行适当的修剪，以确保组织的厚度能够匹配用于制备石蜡块的标准组织处理盒。建议的组织厚度一般在5—10mm。

• 固定剂选择、固定剂与组织的比例：推荐使用10%的NBF进行固定，且固定剂和组织的比例为20：1。

• 固定时间，温度，组织固定应在4℃下进行16—24小时。具体的固定时间需要根据组织自身情况进行调节。操作时应确保组织完全浸没在固定液中并进行轻微搅拌。

组织处理

处理不得当会直接影响RNA质量。

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脱水：组织固定后会进行脱水处理，主要通过浓度梯度的乙醇来不断代替组织中的残留水分。脱水不充分会导致组织形态保存不完整，不利于后续的切片。

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透明：指使用有机溶剂对组织中的乙醇进行 “清除”。透明不彻底可能会导致浸蜡不充分，从而形成难以切片的硬脆组织块。

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浸蜡：透明处理之后的组织需要进行充分地浸蜡处理。浸蜡不充分会导致最后的石蜡块中出现空洞以及缝隙，不利于切片。浸蜡时，要先在60-62℃下将蜡熔化为蜡液，再将组织浸入蜡液中保温，然后冷却至20℃。

Tips：包埋过程中需避免温度过高且需要定期检查温度，可选择低熔点的高质量蜡块。

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包埋：完成上述步骤后，组织被包埋在石蜡中。

Tips：在石蜡包埋过程中记录组织的方位，以确保在后续切片时能够准确定位感兴趣的组织区域。

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实验操作Tips：

1. 定期更换固定和包埋过程中使用的试剂。

2. 切勿将样本长时间储存或放置在固定液中，否则会导致过度固定。

3. 固定、脱水、透明、浸蜡及包埋应在短时间内连续操作并完成实验。如果无法立即进行脱水，可将组织从固定液转移到70%乙醇中短期保存。

4.妥善保存石蜡块以保持完整性。避免将石蜡块暴露于高温或潮湿环境中。为获得最佳储存效果，请在4°C下储存。

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