山大丁兆军团队转录+代谢揭示苯氧乙酸调控大豆根瘤共生的奥秘

豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用对农业生产具有重要意义。根际分泌物是植物与根瘤菌互作的关键信号分子。黄酮类化合物是已知的根瘤形成信号分子，能够激活根瘤基因的表达并诱导根瘤菌释放结瘤因子。酚酸类化合物在豆科植物与根瘤菌的共生关系中也发挥重要作用，但对其功能和调控机制的研究相对较少。2024年9月6日，山东大学生命科学学院丁兆军教授团队在国际学术期刊PNAS上发表了题为“Phenoxyacetic acid enhances nodulation symbiosis during rapid growth stage of soybean”的研究论文，本研究利用代谢组学方法对大豆不同生长阶段根系分泌物进行了分析，解析苯氧乙酸作为一种信号分子促进大豆根瘤发生的分子机制。迈维代谢为该研究提供了植物广泛靶向代谢组检测服务！

1.对比大豆不同生长阶段的根瘤数量，发现快速生长期根瘤数量显著增加。收集不同生长阶段大豆根分泌物进行表型分析，发现快速生长期根分泌物显著促进根瘤形成。

2.代谢组学分析发现，酚酸类化合物在大豆快速生长期显著上调，其中包括邻苯氧乙酸 (POA)。表型实验表明，外源POA 处理显著增加了大豆结瘤数量和侵染线的形成。

3.转录组学发现，POA 调节多个共生固氮相关基因的表达，包括miR172c、和。转基因实验证实POA通过调控miR172c-NNC1通路以及表达，从而促进大豆共生结瘤。

1. 大豆快速生长期根系分泌物显著促进了大豆结瘤

植物根系分泌物对土壤微生物群落结构和功能的影响随植物生长阶段不同而有所差异。本研究发现，在大豆生长初期，特别是在幼苗出现后的第21到28天之间，根瘤的数量会有显著增长(图1 a)。因此推测此阶段根系分泌物可能影响与根瘤菌的共生关系。为了验证这一假设，作者根据根瘤数量，将生长初期分为缓慢生长期(发芽后2周)和快速生长期(发芽后4周)，并在两个生育期的大豆上分别接种和不接种大豆慢生根瘤菌USDA110，收集水培植株的根系分泌物进行结瘤试验(图1 b)。结果表明，无论接种(图1 c-d左)还是不接种根瘤菌(图1 c-d右)，与对照相比，快速生长期根系分泌物处理根瘤数量都显著增加，而缓慢生长期根系分泌物对根瘤数量的影响在统计学上不显著。以上结果证实了大豆快速生长期的根系分泌物能够显著促进大豆结瘤。

图1. 大豆快速、缓慢生长期根系分泌物对结瘤的影响

2. 不同生长阶段代谢物组成和含量变化

为了探索不同生长阶段根系分泌物的变化模式，作者利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC–MS/MS)技术研究了大豆根系分泌物在不同植物生长阶段和接种状态下的变化。作者首先比较了接种和不接种根瘤菌植株根系分泌物变化，在不接种的大豆根系分泌物中鉴定出355种代谢物，包括脂质、有机酸、氨基酸及其衍生物、生物碱、核苷酸及其衍生物、酚酸、黄酮类化合物等(图2 a)。在接种根瘤菌的植株根系分泌物中，共鉴定出928种代谢物，包括黄酮类、酚酸、脂类、氨基酸及其衍生物、有机酸、核苷酸及其衍生物、生物碱、萜类、木脂素和香豆素、单宁等(图2 b)。与不接种的大豆相比，接种了根瘤菌的大豆根系分泌物组成发生了显著变化，且接种植株根分泌物中几乎所有主要物质的含量都高于未接种植株样本，特别是类黄酮和酚酸(图2 c-d)。

图2. 接种根瘤菌对根分泌物组成和含量的影响

作者进一步针对大豆不同生育期的根系分泌物组成和分泌量进行比较，接种根瘤菌(图3 a-b)和不接种根瘤菌(图3 c-d)大豆植株试验组中，与缓慢生长期相比，快速生长期的大豆根系分泌组组成和含量都发生了显著变化。其中酚酸类化合物在无论是否接种根瘤菌的情况下，快速生长阶段的大豆根部渗出物中酚酸的含量都显著增加。黄酮类化合物在没有接种根瘤菌的情况下，快速生长期的大豆根系分泌物中黄酮类化合物的含量是增加的。然而，接种根瘤菌后，与缓慢生长期相比，快速生长期的大豆根系分泌物中黄酮类化合物的含量显著下调。以上结果说明，大豆在快速生长阶段通过分泌酚酸，来促进根瘤的形成。酚酸可以帮助根瘤菌侵染大豆根部，并促进根瘤原基的形成，从而增加根瘤的数量。在快速生长阶段，黄酮类化合物水平的下降表明可能实现了有效的根瘤菌定植。

图3. 大豆根系分泌物的组成在不同的生长阶段发生变化

3. 不同生长阶段代谢物差异分析和功能分析

作者使用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来评估大豆根分泌物代谢物在不同生长阶段和接种状态下的差异。OPLS-DA 得分图表明，不同的比较组之间存在统计学意义上的显著分离（图4 a）。根据|log2 fold change|≥1,VIP≥1,P ≤ 0.05进行差异代谢物筛选，不接种根瘤菌的植株快速生长期和缓慢生长期相比，差异代谢物有78种，其中上调58种，下调20种。接种根瘤菌的快速生长期和缓慢生长期相比，差异代谢物有147种，其中64种代谢物上调，83种代谢物下调(图4 b)。KEGG富集分析发现，在没有接种的情况下，快速生长期和缓慢生长期之间的差异代谢物主要在淀粉和蔗糖代谢、异黄酮生物合成、光合生物的碳固定、玉米素生物合成、维生素B6代谢等代谢途径中进行了注释和富集(图4 c)。接种植株的快速生长期和缓慢生长期差异代谢物主要富集于黄酮和黄酮醇生物合成、戊糖和葡萄糖酸盐相互转化、异黄酮生物合成、抗坏血酸和交替代谢等代谢途径(图4 d)。在两组共有的代谢途径中，异黄酮生物合成途径明显富集，但两组中的异黄酮生物合成途径的整体变化是相反的。差异丰度评分(DA score)显示，与异黄酮生物合成途径相关的代谢物的总体趋势在未接种组中上调，而在接种组中下调。黄酮和黄酮醇生物合成途径相关代谢物也在接种组中下调(图4 c-d)。以上结果说明，黄酮类化合物的分泌受到严格调控，植物在这些生长阶段精细地调节黄酮类化合物的释放，以防止根瘤菌的过度刺激和随后激活强大的植物防御反应。

图4. 缓慢生长期和快速生长期代谢物差异积累的KEGG功能注释和富集分析

4. POA对大豆共生结瘤的影响

以上初步数据表明，某些根分泌物对促进根瘤菌共生的积极影响主要取决于植物的发育阶段，而不是根瘤菌的接种(图1 c-d)。因此，作者鉴定了受发育阶段影响但不受接种影响的不同代谢物。韦恩图显示大豆根系分泌物在缓慢生长期和快速生长期有7种共有的差异代谢物(图5 a)。分析发现其中3种代谢物不受接种影响，在快速生长期表现出上调。苯氧乙酸(POA)是一种无活性的生长素类，其表达上调最为显著(图5 b)。定量分析显示，快速生长时期的POA浓度显著高于缓慢生长时期。为了进一步验证POA对结瘤的促进作用，作者对大豆植株外源施用不同浓度POA处理。与对照相比，外源施用POA能够增强大豆结瘤，适宜浓度的POA能显著增加结瘤数量和侵染线数量，过高浓度则抑制结瘤(图5 c-d)。基于这些结果，作者推断POA可以通过促进侵染线形成和结瘤发育，对共生结瘤具有积极的促进作用。

为了探究 POA 促进共生结瘤的分子机制，作者对大豆根进行了转录组测序分析，比较了POA处理与去离子水处理分别接种和未接种根瘤菌的大豆根中基因的表达。与去离子水处理的未接种根瘤菌大豆植株相比，POA处理的未接种根瘤菌大豆中共有3,072个DEGs。与去离子水处理的接种根瘤菌大豆植株相比，POA处理的接种根瘤菌的大豆植株鉴定出了1,448个DEGs(FC ≥ 2，p ≤ 0.05)。GO和KEGG富集分析发现，POA处理在接种植物中富集了乙烯活性信号通路的负调控和异黄酮生物合成途径。GSEA进一步揭示了POA通过负调控乙烯活性信号通路来增强共生结瘤过程。这种负调控在接种后尤为显著，对促进大豆共生结瘤起到了关键作用。

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图5. POA促进大豆共生结瘤

5. POA对共生固氮相关基因表达的影响

转录组聚类热图结果表明POA处理显著调节了参与共生固氮(SNF)基因的表达(图6 a)。为了验证转录组结果，作者进行了RT-qPCR分析，结果与转录组结果一致。RT-qPCR结果表明POA处理诱导了()基因的表达，该基因参与赤霉素合成并在根瘤菌侵染和根瘤发育中发挥作用。同时，POA处理还上调了基因的表达，该基因参与调节侵染线的形成。此外，POA处理诱导了miR172c的表达，并抑制了的表达(图6 b)。microRNA172c (miR172c)已被证明可以靶向AP2抑制转录因子NNC1，激活结节起始过程中的表达。综上所述，这些结果提示POA可能通过调节SNF基因的表达，促进植物与根瘤菌的共生结瘤过程。

为了进一步验证POA通过调控miR172c-NNC1途径对大豆共生结瘤的影响，作者进行了两种转基因毛根转化实验。一种是通过STTM-miR172c抑制miR172c的活性，另一种是通过过表达来稳定的表达。实验结果显示，对照组在POA处理后根瘤数量增加，而STTM-miR172c和转基因毛根在POA处理后根瘤数量没有显著增加(图6 c-d)。这表明POA对根瘤形成的促进作用在这两种转基因毛根中被消除，从而证实了POA通过下调和上调gma-miR172c来调节miR172c-NNC1途径，进而促进大豆共生结瘤的过程。

为了验证为了研究POA诱导的表达上调是否会影响侵染线的形成，作者创建(amiRNA)- GmGA2ox10转基因毛根系并观察POA处理后的侵染线形成情况，研究发现POA诱导的表达上调对侵染线形成是必要的。在表达被下调的转基因毛根中，POA处理未能增加侵染线的形成，而在对照组中则观察到侵染线发育的增强(图6 e-f)。这表明POA促进侵染线形成的作用需要功能性。另外，GSEA分析表明POA抑制了赤霉素信号传导，提示POA可能通过诱导表达来降低大豆内源赤霉素水平，进而促进根瘤菌侵染。

总结来说，这些发现共同表明，在大豆的快速生长阶段，大豆分泌POA以诱导的表达，从而促进根瘤菌侵染。同时，通过诱导gma-miR172c的表达，它们减轻了的抑制作用，从而促进结瘤形成。最终，导致在大豆快速生长阶段结瘤数量的增加。

图6. POA通过共生固氮基因的差异表达影响结瘤

本研究在大豆生长早期发现根瘤数量随生长阶段显著变化，特别是在出苗后21至28天根瘤迅速增多，表型实验证实了这一增长现象与大豆快速生长期的根系分泌物密切相关，该时期的根系分泌物能够显著促进大豆结瘤。代谢组学分析显示在快速生长期内，酚酸类化合物显著上调，尤其是苯氧乙酸。外源施用苯氧乙酸能够有效促进大豆根瘤的发育及侵染线的形成。转录组分析表明，苯氧乙酸可调控多个与共生固氮相关基因的表达水平。在苯氧乙酸处理后，miR172C和的表达均显著上调。在抑制miR172C和表达的转基因系中，苯氧乙酸促进根瘤发育及侵染线形成能力则显著降低，说明其通过调控相关通路促进大豆结瘤。本研究首次揭示了大豆在生长早期根瘤快速增加的分子机制，并鉴定出能够促进大豆共生固氮的苯氧乙酸，为其在增强根瘤共生及促进农业可持续发展中的实际应用奠定了理论基础。