石河子大学研究揭示野菜“猪毛菜”中的三种成分具有延年益寿效果

衰老是一个复杂的生物学过程，与一系列疾病相关。细胞衰老以细胞周期阻滞、细胞凋亡抵抗和衰老相关分泌表型(SASP)的产生为特征，是对各种内源性和外源性应激的反应。因此，衰老细胞(SnCs)招募炎症细胞，重塑细胞外基质，破坏正常组织功能，这使得SnCs成为年龄相关疾病的可靠靶点。过去几十年的研究表明，老年治疗策略可以可分为清除SnCs的senolytic治疗和减少SASP的senomorphic治疗，两者都是干预衰老和治疗年龄相关疾病的有希望的方法。

几千年来，天然产品一直是中国预防和治疗人类疾病的首选。这些药物包含了深厚的传统知识，是药物开发的重要资源。中草药具有多组分、多靶点的特点，由多种活性化合物组成，并与多个靶点相互作用。

2024年7月29，Advanced Science在线发表了石河子大学联合多个单位利用网络药理学、代谢组、western blot、RT-qPCR等技术手段对猪毛菜提取物延长线虫、小鼠寿命的能力的研究结果。在这项工作前，作者收集了来自中国西南部云南省的836种中草药提取物，从而建立了一个独特的植物提取物文库。通过评估每种植物提取物延长秀丽隐杆线虫(C. elegans)寿命的能力，最后发现了猪毛菜(JM10001)(图1a)。本研究则是深入解析猪毛菜是否具有延长线虫的深入研究。

1. 猪毛菜延长野生型线虫的寿命和健康寿命

将不同浓度的猪毛菜提取物施用于秀丽隐杆线虫(N2)，以评估其调节寿命的功效。结果表明，100、200和400mg L的猪毛菜提取物处理分别使平均寿命延长了9.9%、19%和8.6%(图1b)。值得注意的是，200mg L浓度的猪毛菜提取物表现出最显著的寿命延长，因此选择了该浓度进行后续实验。

在详细的寿命研究之前，针对猪毛菜提取物是否可以抑制标准饮食喂养的秀丽隐杆线虫中大肠杆菌OP50(E. coliOP50)的生长，以排除饮食限制的潜在混淆效应。用紫外可见分光光度计收集猪毛菜提取物处理后大肠杆菌OP50在不同时间点的生长数据。结果表明200mgL猪毛菜提取物没有抑制细菌生长（图1c），证实其抗衰老作用不是由饮食限制引起的。随后评估猪毛菜提取物对线虫的运动行为(咽泵和身体弯曲：通常用于评估健康寿命的指标)的影响。结果表明，猪毛菜提取物处理后8天显著增强了线虫咽泵速率和体弯曲(图1d,e)。

此外，抗氧化能力也是评价健康寿命的重要指标。因此进一步进行DPPH实验、百草枯诱导模型存活率实验、DCFH-DA荧光实验、mRNA表达实验等相关实验。DPPH结果表明在3.9~ 125.0 mgL的浓度范围内，猪毛菜提取物对DPPH自由基具有剂量依赖性的清除作用，表明其具有很强的抗氧化活性；百草枯诱导模型存活实验结果表明，猪毛菜提取物处理显著增强了线虫氧化应激抵抗能力，平均寿命延长62.1%(图1f)；DCFH-DA荧光探针观察到猪毛菜提取液处理组在处理4天后ROS荧光强度较对照组降低(图1g)。此外，猪毛菜提取液处理组超氧化物歧化酶基因(sod-2、sod-3和sod-4)mRNA表达水平上调(图1h)。综上所述，这些发现表明猪毛菜提取液有效地延长了秀丽隐杆线虫的寿命，增加了它们的健康寿命。

■ ■ ■ ■ ■

图1.猪毛菜提取物处理线虫的各项生理生化指标检测

2. 猪毛菜抗衰老关键化合物及蛋白

使用了网络药理学方法探索猪毛菜提取物潜在的抗衰老机制。从GeneCards、DrugBank和CTD数据库中确定了363个与年龄相关的靶点。随后，从相关文献中找到猪毛菜中的64个成分，并利用Lipinski的五法则筛选出34个潜在活性化合物。此外从TCMSP和SwissTargetPrediction数据库中收集了这些活性化合物的327个潜在靶点。利用Venn图来找到JM10001靶点与年龄相关蛋白之间的重叠蛋白。最终获得了81个重叠蛋白，并用于构建蛋白-蛋白相互作用网络(图2a)。

为了阐明这81个关键靶点的潜在机制，对靶点进行GO和KEGG分析。GO分析揭示了这些靶点与生物机制之间的显著相关性，包括细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的调节。KEGG分析表明，猪毛菜提取物的抗衰老作用是通过多种生物学途径介导的，包括p53信号通路、细胞周期、T细胞受体信号通路和MAPK信号通路(图2b)。

猪毛菜提取物的关键靶点主要集中在p53信号通路内，大量研究表明p53可能影响与年龄相关的衰老进程。先前的研究表明，与哺乳动物p53同源的秀丽隐杆线虫的cep-1随着年龄的增长而逐渐增加。为了确定这一机制是否有助于猪毛菜提取物的抗衰老作用，进行了评估cep-1突变体蠕虫寿命的实验。结果表明猪毛菜提取物并没有延长cep-1突变体蠕虫的寿命（图2c），这表明cep-1/p53信号通路对其抗衰老是不可或缺的。随后研究了JM10001对cdk-2的影响，因为p53与下游靶标cdk-2相互作用，cdk-2是一个预测的靶标，其表达减少已被证明可以延长秀丽隐杆线虫的寿命。同样，猪毛菜提取物并没有延长cdk-2突变虫的寿命，其中cdk-2是哺乳动物中cdk-2的同源基因。此外在猪毛菜提取物处理后秀丽隐杆线虫中观察到cdk-2的表达显著降低。这些结果进一步证实了p53信号通路在猪毛菜提取物寿命调控中的关键作用。

中药的安全性和有效性在联合治疗的发展中受到高度重视。因此，为筛选得到JM10001中潜在的有效组件。根据结构相似性，将猪毛菜提取物的关键成分分为三类:类黄酮、甾醇和酚类(图2d)。组分靶标信息分析显示，槲皮素(Q,Mol048)、β-谷甾醇(β，Mol021)和水杨酸(S,Mol012)在这些类型框架中具有最多的靶标(图2e)。Q、β和S的组合包含75个目标，几乎与物质-靶点网络中JM10001有效组分识别的81个目标相匹配。随后，使用代谢组学技术手段确认了猪毛菜提取物中存在Q、β、S。考虑到这些发现，最后选择Q、β和S作为猪毛菜提取物的代表性化合物进行联合治疗的进一步研究。

■ ■ ■ ■ ■

图2.机制研究和成分发现

3. JM10101延长秀丽隐杆线虫的寿命和健康期

为了确定抗衰老组合物槲皮素+β-谷甾醇+水杨酸的最佳比例和浓度(图3a)，在线虫中评估了64种不同浓度的组分组合(图3b)，经过两次筛选。结果表明JM10101两次均表现出更好的寿命延长活性。

为了探索JM10101的潜在协同效应，利用JM10101及其单独的成分（0.30mg L槲皮素,0.41 mg Lkgβ-谷甾醇和0.14mg Lkg水杨酸）对线虫进行了不同的处理（图3c），JM10101组延长了线虫的寿命17.1%，超过了单独的槲皮素(8.8%)，β-谷甾醇(9.5%)和水杨酸(8.5%)处理组。值得注意的是，JM10101(17.1%)比JM10001(13.1%)表现出更好的寿命延长效果。这些结果表明，JM10101具有协同延长线虫寿命的作用。

通过监测线虫的运动行为，进一步评估JM10101对健康寿命的影响。结果显示，JM10101显著增强了大鼠的运动性、咽泵和身体弯曲(图3d-f)。最后验证了JM10101的预测机制，它不会延长cap-1或cdk-2突变体线虫的寿命，而且会降低野生型线虫中cdk-2基因的表达(图3h)，支持cap-1/p53信号通路是其抗衰老作用的可靠机制。这些实验结果证实，JM10101维持了JM10001在秀丽隐杆线虫中延长寿命和提高健康寿命的作用。

■ ■ ■ ■ ■

图3.组合物JM10101延长秀丽隐杆线虫的寿命和健康期

4. JM10001和JM10101延缓MRC-5细胞衰老的作用

对JM10001和JM10101在MRC-5细胞（细胞衰老研究的理想模型）中的抗衰老作用进行实验。选择了50mg L 的JM10001和6.2mg L的JM10101（两者都没有明显的毒性）进行进一步的实验。结果显示，与对照组相比，经JM10001或JM10101处理的MRC-5细胞传代后期SA-β-gal阳性细胞比例显著降低(P39)(图4b,c)。

Westernblot和RT-qPCR分析显示，在JM10001或JM10101治疗后，p53和p21的表达显著降低(图4d-h)。此外通过免疫荧光检测MRC-5细胞中的衰老标志物γH2AX，发现JM10001和JM10101减少了γH2AX的病灶数。此外，与JM10001相比，JM10101表现出更强的降低SASP因子表达的能力，包括IL-1、MMP-1、MMP-2、CCL-2、IL-6、MIF和CXCL-2(图4i-1)。此外，研究结果还表明，JM10101对上述SASP因素的降低效果优于其单体高剂量(3倍)，突出其协同抗衰老作用(图4i-l)。总的来说，这些发现表明JM10101比JM10001具有更大的senomorphic药物潜力。

■ ■ ■ ■ ■

图4.JM10001和JM10101延缓MRC-5细胞衰老的作用

考虑到该成分包含槲皮素，一种选择性消除SnCs的抗衰老药物，进而对JM10101及其单体在MRC-5细胞不同传代中的SnCs消除能力进行检测（图5a,b），随着浓度的增加，JM10101在P41的衰老细胞中表现出比P29的年轻细胞更强的细胞毒性，证实了其作为类似于槲皮素的抗衰老药物的功效。然而，在P41和P29的MRC-5细胞中，水杨酸和β-sitosterol在测试浓度下表现出最小的细胞毒性。为了准确评估SnCs消除能力，采用半最大抑制浓度(IC50)来衡量细胞活力抑制。IC50值表明，与β-sitosterol和水杨酸相比，JM10101和槲皮素都具有更强的SnCs消除能力(图5c)。值得注意的是，19.5mg L的JM10101，含有6.8mg L的槲皮素，表现出与12.2mg L的槲皮素相当的抗衰老能力，这表明JM10101对衰老细胞更有效，比槲皮素更有抗衰老作用。

为了进一步评估JM10101作为抗衰老剂的有效性，利用小鼠胚胎成纤维细胞(mef)进行实验，研究结果表明，P9mef (IC50 = 67.1 mg L)比年轻的P4mef (IC50 = 293.2 mg L)更敏感，表明JM10101选择性地消除了P9mef中的SnCs。为了阐明JM10101延缓衰老的作用机制，利用流式细胞术分析了JM10101治疗后细胞周期进展和凋亡情况。结果表明，与对照组(9.3%)相比，6.2mg LJM10101处理组的衰老细胞明显阻滞在S期(16.4%)，而50mg LJM10001处理组未观察到明显的细胞周期阻滞(图5d,e)。同时，流式细胞术分析显示，与年轻的P29细胞相比，老年P41MRC-5细胞中凋亡细胞的数量更高(图5f,g)。综上所述，JM10001和JM10101均能改善MRC-5细胞的衰老，且JM10101同时具有同胚性和衰老性，发挥了独特的同胚性作用。

■ ■ ■ ■ ■

图5. JM10101对MRC-5细胞衰老相关特性的影响分析

5. JM10001和JM10101对阿霉素致小鼠衰老的影响

为了评估JM10001和JM10101对小鼠抗衰老作用，构建了阿霉素诱导衰老的小鼠模型(图6a)。其中，8周龄C57BL/6J雄性小鼠(年轻对照组)分别于第0天和第10天腹腔注射5mg kg阿霉素建立老年对照组。从阿霉素注射后第16至37天，将小鼠分为5组，每组每天灌胃1g kg JM10001、2g kg JM10001、12.5mg kg JM10101、50mg kg JM10101或二甲双胍(20mg kg ，作为阳性对照)。既往研究表明，阿霉素可显著提高血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平，并诱导肾内SA-β-gal过表达。

研究结果表明，JM10001和JM10101有效地抵消了血浆中ALT(图6b)和AST(图6c)的不良升高，并显著降低了肾脏SA-β-gal水平(图6d,e)。同时检测γH2AX的表达情况，观察到肝脏和肾脏中γH2AX和p53蛋白水平降低(图6f-k)，证实了先前网络药理学分析的结果。因此研究结果表明，JM10001和JM10101可以有效地对抗小鼠药物诱导的衰老。

■ ■ ■ ■ ■

图6.JM10001和JM10101对阿霉素致小鼠衰老的影响

6. JM10001和JM10101对自然衰老小鼠的影响

为了进一步评估JM10001和JM10101对自然衰老小鼠抗衰老作用，对18月龄小鼠进行了为期3个月的研究。根据实验方案，延长治疗期需要减少剂量，因此将JM10001和JM10101的剂量分别调整为0.5g kg 和25mg kg 。

随后测量五组小鼠肝脏和肾脏中的衰老生物标志物。研究结果显示，老年小鼠血清中ALT、AST、Cr和BUN水平显著升高，但在给予JM10001或JM10101后成功降低。这一观察结果表明，给予JM10001和JM10101可显著缓解肝肾功能下降。同时病理实验表明JM10001和JM10101显著减少了肝脏和肾脏的衰老细胞数量和纤维化。进一步分析表明，JM10001和JM10101降低了自然衰老小鼠肝脏和肾脏中α-smooth肌动蛋白(α-SMA)和羟脯氨酸(HYP)的水平。

此外，在血清、肝脏和肾脏中观察到SASP因子显著改善(图7a-d)。此外，自然衰老的小鼠表现出行为反应下降，给药后恢复(图7e-g)。随后在自然衰老小鼠的肝脏和肾脏中进行的机制研究证实，JM10001和JM10101的抗衰老作用是通过p53信号通路介导的，进而调节p21和p16的水平(图7h-0)。

为了评价JM10001和JM10101的安全性，对小鼠进行了重复给药毒性实验。结果显示，重复给药14天后体重无不良变化，JM10001(5 g kg，最佳治疗剂量的5倍)和JM10101(500 mg kg -1，最佳治疗剂量的10倍)均通过灌胃给药。此外，14天后，主要器官(心、肝、脾、肺和肾)的相对重量未见有害变化。检测血清生化指标，包括ALT、AST、尿素和肌酐(Cr)，显示小鼠服用JM10001导致ALT水平下降，但仍在正常范围内(平均范围为10.1-96.5UL)。此外，AST、尿素和Cr均未见明显变化。JM10101与对照组血清指标无显著差异。此外，使用形态学和苏木精-伊红染色进行组织形态学分析，显示对器官没有不良影响。总之，这些发现证实了JM10001和JM10101的安全性，为它们作为治疗剂的进一步开发提供了有力的证据。

■ ■ ■ ■ ■

图7.自然衰老小鼠SASP因子表达、生理功能评价及机制验证

本研究结合网络药理学和代谢组筛选出猪毛菜提取物中3个典型物质：槲皮素、β-谷甾醇、水杨酸。同时通过细胞、衰老模型小鼠、自然衰老小鼠验证这三种物质的混合物和单体延缓衰老的效果，结果表明三种物质的混合物具有更好的延缓衰老的效果，同时按照一定比例和浓度混合的效果比原始的猪毛菜提取物具有更好的效果。

这一篇文章是非常典型的中药机制研究，而在筛选入血成分的时候利用Lipinski五项原则筛选也是我们网络药理学分析内的一个重要筛选原则。那么对于研究中药机制的研究思路我们可以参考以下两种类型：

1. 对于中药入血成分分析可以结合代谢组学技术对中药植物和血液样本进行检测后，结合分子对接和一些体外的细胞实验来验证成分的功能。

2. 对于更加细致的中药药理研究则可以结合其他组学技术开展，这样的研究思路也在今年公布的2023年中医药学术十大进展有着典型的案例。具体文献参考以下链接https://mp.weixin.qq.com/s/HPj70PvX_4Wb8E2I2f3BbQ

■ ■ ■ ■ ■

中药入血成分分析产品介绍

1. 4针检测：液相质谱联用高分辨质谱仪+低分辨质谱仪双管齐下

利用高分辨质谱仪采集成分的RT、二级质谱图等信息，与本地自建数据库进行物质信息匹配（二级镜像匹配）；其次利用低分辨质谱仪中业内金标准MRM模式对样本中的成分含量进行测定。

■ ■ ■ ■ ■

物质鉴定二级镜像匹配

2. 自建本地数据库MetTCM：33000+种次生代谢成分

2024年上半年，我们完成中药入血成分分析产品数据库的升级，本次加入超过5000中来源的次生代谢物。利用标准品在样本检测相同条件下建立完整的物质信息库，目前已建立包含有33000+种中药成分的物质库，广泛覆盖黄酮、萜类、生物碱、香豆素、木脂素、醌类等多种在中药中发挥药效作用的成分，数据库物种覆盖超过500+种《中国药典》2020版中的物种类型。

3. 严格的物质定性标准

对于中药研究来说，不论是对中药原始植物，还是经过炮制过程的中药药材，成分鉴定准确性对于后续药理的研究极其重要。因此我们针对物质鉴定建立严格的物质准确性标准，在交付结果中严格划分物质定性等级。

4. 物质鉴定水平

对于中药植物、中药复方、血液、动物组织样本，我们具有丰富的项目经验，对于中药植物、中药复方类型的样本，物质检出水平在1000-3000，对于血液和动物组织样本，物质检出水平在300-1000。极大程度的挖掘中药植物、复方、血液和组织中的中药成分。

5. 分析内容：网络药理学分析

对于中药的研究来说，成分鉴定只是第一步，下一步则是进行药理机制的研究。而在近日发布的2023年十大中医药学术进展中其中一个部分则是强调网路医学的使用，在我们的分析中，则将网络药理学分析内容作为标准分析进行交付。