深度解读外泌体：形成构成、分离及鉴定、功能和应用

作者：科研根号三发布时间：2024-10-16

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一、外泌体的形成及构成

1）什么是外泌体？

外泌体（Exosome）是细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）的一种，是由脂质双分子层包裹的微小囊泡，直径一般为 40-100nm1 。外泌体的膜主要由脂质和蛋白质组成，其内容物中除蛋白质外还发现了多种核酸，包括 DNA 、mRNA、microRNA 和 ncRNA 等。

外泌体可以由所有细胞类型分泌,包括免疫细胞、神经元细胞、上皮细胞、内皮细胞、胚胎细胞、癌细胞和间充质干细胞等，广泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁、胆汁等各种体液中。

注1：不同文章中对外泌体直径的定义有所不同，30-200nm是个较大区间，40-100nm是一个常用范围。

2）外泌体的形成

外泌体源自于细胞质膜的内吞作用。细胞质膜内陷形成早期内体（Early Endosome），而早期内体质膜内陷出芽形成多泡体，多泡体外膜与细胞膜融合后，向细胞外释放出外泌体。

在外泌体形成过程中，供体细胞的胞质内容物会被装载到外泌体中，一起被供体细胞通过胞吐作用分泌到细胞外，进而通过受体-配体相互作用的方式传递给受体细胞。

3）外泌体蛋白类型

由于外泌体的独特形成方式，其尺寸、内容物、功能和来源均具有异质性。不同类型细胞分泌的外泌体组分有所不同，甚至相同类型细胞分泌的外泌体也可能存在差异。但是在蛋白类型上，外泌体还是有一些规律可循。

外泌体蛋白一般包括：整体外泌体膜蛋白、内外周膜蛋白、脂质锚定外膜蛋白、脂质锚定内膜蛋白、外围表面蛋白和外泌体酶。其中一些广泛分布和细胞特异性的蛋白会被定位到外泌体中，包括细胞骨架蛋白、代谢酶、信号转导分子、热激蛋白（HSP70和 HSP90）、四次跨膜蛋白（CD9、CD63 、CD81 和 CD82）。

值得注意的是，这些已发现的外泌体蛋白中绝大部分也存在于其他类型细胞外囊泡中，包括一些所谓的“外泌体 Marker ”（如热激蛋白、flotillins、MHC 分子）；而同时确有一些外泌体 Marker 被认为是相对特异的，包括 CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix、HSP70 和 HSP90。因此单独外泌体蛋白，是外泌体鉴定的必要不充分条件。

二、外泌体的分离及鉴定

1）外泌体的分离与富集

外泌体的分离和富集主要通过差速超速离心、密度梯度超速离心、过滤、超滤、超滤与超速离心结合、试剂盒提取等传统方法；此外，微珠、微流控芯片和热泳技术等新技术的应用也使得外泌体能够更加快速、方便地富集。

2）外泌体的鉴定

那么分离富集之后，我们又该如何鉴定提取出来的物质是外泌体呢？

上面我们提到外泌体蛋白是外泌体鉴定的必要不充分条件，这是其一，一般使用蛋白质印迹技术（Western blot）鉴定；另外我们还需要至少两种外泌体单个特征的鉴定方法：形态表征的鉴定如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、冷冻电子显微镜（cry o EM）、原子力显微镜（AFM）等；以及粒径分布表征的鉴定如动态光散射（DLS）技术、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、可调电阻脉冲传感（TRPS）等。

1）外泌体蛋白分析

关于细胞外囊泡蛋白层面的表征，国际细胞外囊泡研究协会（ISEV）建议至少检测三类蛋白（两阳一阴）以证明其特征：（A）跨膜或 GP I 锚定蛋白，证明与质膜和/或内体相关，常用的有 CD63、CD9、CD81 等；（B）被囊括进去的胞质蛋白，如 TSG101、HSP70、ALIX 等；（C）存在于其他胞内细胞器的阴性蛋白，如核蛋白 Histone 、 Lamin A，内质网蛋白 calnexin，高尔基体蛋白 GM130，线粒体蛋白 cytochrome c，以及细胞骨架蛋白 cytokeratin 18 等。

注：由于目前的提取技术无法获得完全纯化的外泌体，因此 ISEV 建议将提取到的小于 200nm 的囊泡统称之为小细胞外囊泡（small extracellular vesicle，sEV），sEV 这一概念也被越来越多的论文采用及被越来越多的杂志接纳。

其中，CD63、CD9、CD81 以及 TSG101、HSP70 、HSP90 、ALIX 等是最常用到的外泌

体标志物。

2）外泌体形态和粒径分布分析

透射电子显微镜（TEM）被认为是识别和表征单个外泌体的常用方法。TEM 视野下，外

泌体呈圆形或杯状结构，大小范围为 40-150nm。

纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种广泛用于确定外泌体浓度和尺寸分布的方法。外泌体

的粒径分布区间在 40-150nm。

图 5 外泌体形态和粒径分布分析源自[6]

A.TEM 分析 B. NTA 分析

经过了蛋白维度、形态维度以及粒径分布维度三个层面的表征，我们基本可以确

认分离出的组分为外泌体。

三、外泌体的功能和应用

外泌体能够将核酸、蛋白质和脂质在内的多种生物活性分子从供体细胞转移到受体细胞，介导细胞间通讯和分子转运；并且外泌体可以由所有类型的活细胞分泌，在体液中广泛分布。因此外泌体在生理病理标志物和药物递送方面有巨大的应用潜力。

1）外泌体作为肿瘤液体活检的新前沿

癌症是全世界人口死亡的主要原因之一。相比于传统的组织活检，液体活检侵入

性极小、样本易收集，逐渐成为癌症诊断和预后预测的新策略。

注：液体活检包括循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤 DNA（ctDNA）和外泌体三种
检测。

外泌体携带的内容物不仅能够反映亲本细胞的生理病理特征；它还具有脂质双分子层的稳定结构，即使在恶劣的肿瘤微环境下也能够稳定循环；而且体液中包含大量外泌体。因此外泌体成为液体活检中最具潜力的新型生物标志物。

据已有报道，外泌体蛋白和外泌体 RNA 均可成为癌症早期诊断标志物：

非小细胞肺癌：非小细胞肺癌占肺癌死亡人数的 80%以上。非小细胞肺癌患者和健康者之间血液中外泌体 miRNA-21、miRNA-378 、miRNA-139 和 miRNA-200 存在差异
表达，为非小细胞肝癌的早期诊断提供了更多可选的生物标记物[7]。
肝癌：外泌体 miRNA-21 抑制肝癌细胞的凋亡，并在肝癌患者中上调；CEA 和 GPC-3
等外泌体蛋白能够区分肝癌患者和健康者，是无创性癌症诊断的潜在生物标记物。
胃癌：外泌体 miRNA-15b-3p 在胃癌组织、细胞系和血清中高表达，血清外泌体 miRNA-15b-3p 可作为一种潜在的胃癌诊断和预后生物标志物，可用于胃癌的精准靶向
治疗[8]。
乳腺癌：乳腺癌是女性癌症相关死亡的最常见原因。癌细胞衍生的外泌体
miRNA-21、miRNA-222 和 miRNA-200c 可以在体液中定量，并用于乳腺癌诊断[9]。
结直肠癌：结直肠癌是造成全球癌症相关死亡的第二大原因。结直肠癌患者血清
中外泌体 C ircRNA-0004771 上调，可以区分 I 期和 II 期结直肠癌患者与其他良道疾病，因此可以作为结直肠癌的潜在诊断标记物[10]。此外，miRNA-15b、miRNA-21 和 miRNA-31 在结肠癌患者的血清外泌体中高度表达，对结直肠癌的诊断有潜在的应用价值[11]。
胰腺癌：外泌体 miRNA-10b 是胰腺癌进展相关的公认指标之一，广泛用于胰腺导管腺癌的早期诊断。g lyp ican-1（GPC1）特异性地富集于肿瘤细胞来源的外泌体上，富含 GPC1 的循环外泌体（GPC1+crExos）能绝对特异而敏感地在胰腺癌患者的血清中检测到，将早期和晚期胰腺癌患者与良性胰腺疾病患者和正常群体区分出来[12]。
前列腺癌：相比于广泛使用的前列腺癌的生物标记物 PSA，外泌体 ephrinA2 能够更准确的区分前列腺癌患者和前列腺增生患者[13]。此外，前列腺癌患者的血清外泌体中 EpCAM 和 PSMA 的表达增加[14]。

2）外泌体作为无细胞治疗的新兴方案

外泌体作为一种天然的纳米级别运输囊泡，它还具备细胞以及人工合成囊泡（脂质体等）所不具备的一些优良特性，比如说低免疫原性、高耐受性、高通透性、可靶向改造、易获得等。因此其在疾病治疗中应用潜能也吸引了人们的关注。

从树突细胞、成纤维细胞和间充质干细胞分离出来的治疗性外泌体，能够对靶细胞产生特定的作用，比如新抗原呈递、免疫调节和药物有效荷载递送。并且不同的外泌体可以通过不同的进入方式或者互作机制（受体介导的内吞、网格蛋白包被的小孔、脂筏、吞噬作用、胞饮作用等）来控制其对特定靶细胞的影响。其中基于表面配体-受体呈递的外泌体使得精准靶向成为可能。

有研究显示，间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（MSC-sEV）能够模拟其亲代细胞，执行更高安全性和生物相容性的再生能力，恢复靶细胞功能[16]；并且，MSC-sEV 还可以被改造，通过负载一个核酸（si-RCP）而获得缺氧适应性，进而轻松适应生理性

低氧微环境这个天然屏障，抵达椎间盘并发挥功能，治疗椎间盘退变疾病[17]。

也有研究显示，巨噬细胞衍生的外泌体可以直接负载小分子药物紫杉醇（PTX）发挥抗肿瘤作用[18]；并且，该细胞来源的外泌体还能够穿透血脑屏障，将一种货物蛋白（BDNF，脑源性神经营养因子）递送至大脑，发挥中枢神经系统疾病治疗功效[19]。

总而言之，外泌体作为一个天然的信息和物质传递系统，在疾病的诊断和治疗中具有巨大的潜力和应用前景，值得我们投入大量的人力和物力去探索、研究和改造；

这些研究成果也将给肿瘤等疑难杂症的诊断、治疗和预后带来巨大的突破和改变。

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