课程回顾丨点突变细胞株构建策略及其研究应用
9月5日，赛业生物细胞基因编辑项目经理金子力主讲「点突变细胞株构建策略及其研究应用」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。
FAQ:
1.如何鉴定构建的点突变细胞？
2.发现了新的突变位点，是构建细胞模型还是直接构建动物模型？
3.如何提高同源重组效率？
4.悬浮细胞的单克隆筛选有什么步骤？
5.细胞里发生同源重组在S和G2期吗？转入donor后会在哪个时期发生重组？
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Q
如何鉴定构建的点突变细胞？
A
点突变细胞株的鉴定是确保突变成功和准确性的关键步骤。
鉴定点突变细胞的常用方法：通过稀释法将细胞池细胞稀释转移到 96 孔板中，形成单克隆细胞。然后收集单克隆细胞进行大量测序，以得到预期的纯合子细胞的DNA测序。
测序方法：提取细胞的基因组DNA，使用PCR扩增目标基因区域，然后进行Sanger测序或高通量测序。
优点：可以直接确认突变位点的存在及其准确性。
注意事项：确保使用特异性引物，避免扩增非目标区域。
Q
发现了新的突变位点，是构建细胞模型还是直接构建动物模型？
A
如果研究的重点是了解突变对细胞生物学特性的影响（如增殖、凋亡、信号通路等），细胞模型可能更合适；如果突变位点与某种疾病相关，且已知其在体内的生物学功能，构建动物模型可能更有意义。
通常情况下，建议首先构建细胞模型进行初步研究，以快速验证突变的功能和生物学影响。如果细胞模型的结果显示突变具有重要的生物学意义或与疾病相关，再考虑构建动物模型进行更深入的研究。这种逐步推进的策略可以有效节省资源并提高研究的效率。
Q
如何提高同源重组效率？
A
首先优化DNA供体donor载体的构建，选择合适的细胞系（比如用倍增时间快的细胞，培养起来比较简单）。优化转染或转导方法，抑制非同源末端连接（NHEJ），使用小分子抑制剂（如Scr7）来减少非同源末端连接的竞争。可以使用促进同源重组的小分子促进同源重组的发生。
Q
悬浮细胞的单克隆筛选有什么步骤？
A
可以通过以下的一些建议和步骤提高悬浮细胞的单克隆筛选效率：
①细胞准备
细胞培养与计数：确保悬浮细胞在对数生长期，细胞状态良好，活性高。通常在适宜的培养基中培养细胞，保持细胞密度在适当范围内；使用细胞计数板或自动细胞计数仪，准确计数细胞浓度。
②稀释和分配
根据需要的克隆数，稀释细胞至适当浓度。通常，目标是每个孔中有1个细胞；将稀释后的细胞分配到96孔板或其他适合的培养板中。每个孔中加入适量的培养基。
③培养和观察
将细胞培养在适宜的温度和CO₂浓度下，定期观察细胞生长情况；在培养过程中，定期检查每个孔的细胞生长情况，确保每个孔中只有一个克隆在生长。
④克隆挑选
当细胞克隆长到适当大小（通常为几毫米），使用移液器或细胞吸管小心挑选单个克隆；将挑选的克隆转移到新的培养皿中，添加适量的培养基，继续培养。
Q
细胞里发生同源重组在S和G2期吗？转入donor后会在哪个时期发生重组？
A
同源重组主要发生在细胞周期的S期和G2期。这是因为同源重组需要DNA的复制和修复机制，而这些过程在这两个阶段是最活跃的。
在转入donor DNA后，重组最有可能发生在细胞的S期和G2期。如果希望提高同源重组的效率，通常建议在细胞处于这两个阶段时进行转染。通过同步细胞周期或选择合适的细胞类型，可以进一步优化重组效率。
