利用胃癌类器官探索circ_0008315介导的耐药机制
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社
胃癌(GC)化疗过程中顺铂(CDDP)的耐药是一个巨大的挑战。来自皖南医学院第一附属医院(弋矶山医院)左学良、蔡娟团队的最新研究发现circ_0008315能通过miR-3666/CPEB4信号通路加重GC和顺珀耐药，该团队还开发出了靶向circ_0008315的PLGA-PEG纳米颗粒，为circRNAs在癌症纳米治疗策略中的作用提供见解。
文章介绍
题目：Circ_0008315 promotes tumorigenesis and cisplatin resistance and acts as a nanotherapeutic target in gastric cancer
杂志：Journal of Nanobiotechnology
影响因子：IF=10.514
发表时间：2024年8月
#1
研究背景
Background
顺铂(cisplatin, CDDP)作为GC化疗药物之一，其化疗耐药仍然是一个巨大的临床挑战。CircRNAs作为一种新型的非编码RNA，参与肿瘤发生和癌症进展的调控，可以竞争性结合microRNAs(miRNAs)，调控miRNA下游靶基因的表达水平，从而影响GC的进展。Hsa_circ_0008315位于第5染色体上，来源于RASGRF2，circRASGRF2高表达与肝细胞癌不良预后相关。然而，circ_0008315在GC中的作用仍然不清楚。因此，本研究探讨了circ_0008315的表达对GC和顺铂耐药的影响，并开发了靶向circ_0008315的PLGA-PEG纳米颗粒，为GC患者提供纳米治疗候选药物。
#2
研究思路
Methods
通过构建GC类器官模拟体内肿瘤微环境，检测circ_0008315的表达及其对顺铂耐药的影响，并开发靶向circ_0008315的PLGA-PEG(sicirc_0008315#1)纳米颗粒。
#3
研究结果
Results
1.在CDPP耐药GC细胞中发现新的circRNA hsa_circ_0008315，并发现其在GC和顺铂GC中上调
研究人员采用高通量RNA-seq分析了3对胃癌组织和邻近组织，以及CDDP耐药细胞和相应的亲本CDDP敏感细胞中circRNAs表达，在5号染色体上发现了一个新的circRNA hsa_circ_0008315，且多种实验结果均表明circ_0008315在GC组织和抗CDDP细胞中显著上调。分析40例GC患者的生存曲线图，发现circ_0008315高表达的胃癌患者生存期较短，说明circ_0008315的高表达预示着不利的生存结果。(图1)
图1 Circ_0008315在GC组织和CDDP抗性GC细胞中上调
2. Circ_0008315促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭，以及上皮-间质转化(EMT)
研究人员设计了两个siRNAs(si-circ_0008315#1和si-circ_0008315#2)以降低HGC-27和MKN-45细胞中circ_0008315的表达。他们发现，circ_0008315敲低能够降低MKN-45和HGC-27细胞的细胞活力、细胞增殖并且增加MKN-45和HGC-27细胞凋亡。Transwell和伤口愈合实验结果说明si-circ_0008315能够减轻HGC27和MKN-45细胞的侵袭和伤口比例。以上结果说明circ_0008315促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制GC细胞凋亡。(图2)
图2敲低circ_0008315可抑制GC细胞的增殖和迁移
研究人员进行了多个实验分析circ_0008315对EMT标记物的影响，他们发现circ_0008315敲低导致MKN-45细胞向上皮表型转化，且circ_0008315过表达导致MKN-28细胞中梭状间充质细胞的产生。Western blot实验与免疫荧光实验也都证实了，Circ_0008315敲低导致间质标志物N-cadherin和Vimentin含量降低，上皮标志物E-cadherin含量升高。因此，circ_0008315促进GC细胞的EMT。(图3)
图3 Circ_0008315促进GC细胞的EMT
3. Circ_0008315靶向miR-3666和CPEB4靶点
为探究circ_0008315是否可以与miRNAs结合，研究人员分析了circ_0008315的序列，并重叠预测出四个候选miRNAs，在MKN-45和AGS细胞中使用AGO2抗体进行RNA免疫沉淀实验，结果表明Circ_0008315可能作为AGO2和miRNAs的结合平台。为证实miR-3666是否能够抑制GC细胞EMT，研究人员将miR-3666模拟物添加到MKN-45细胞中，然后检测EMT相关标记物的变化，Western blot与免疫荧光实验结果都表明，miR-3666模拟物导致E-cadherin增加，N-cadherin和Vimentin减少，说明miR-366变化也可能导致EMT标记的变异。(图4)
图4 GC细胞中Circ_0008315可作为海绵吸附miR-3666
研究人员通过重叠算法预测，发现miR-3666可以靶向KLF7、PHF20、AGFG1、PRKAA1、CPEB4、CNOT6L、SNX27、ANKIB1和PPP6R2。Circ_0008315敲低后, 发现KLF7和CPEB4的表达水平明显下调,而在HGC-27细胞中，Circ_0008315过表达则导致CPEB4的表达水平高于其他基因。又通过荧光酶素报告基因实验证实了miR-3666的下游是CPEB4 mRNA的3’UTR。还发现CPEB4在GC组织中的表达水平显著上调，circ_0008315敲低可下调MKN-45和HGC-27细胞中的CPEB4，说明circ_0008315水平与CPEB4表达呈正相关。这些结果表明circ_0008315在GC细胞中通过与miR-3666相互作用促进CPEB4的表达。(图5)
图5 miR-3666在GC细胞中靶向CPEB4
4. 抑制miR-3666和CPEB4敲低可降低circ_0008315对GC增殖、迁移和侵袭的影响
研究人员使用miR3666抑制剂进行了拯救实验。他们发现，敲低miR-3666可提高MKN-45和HGC-27的细胞活力和增殖能力，而下调circ_0008315则相反。同时，沉默miR-3666也可恢复circ_0008315对EDU-阳性细胞的抑制作用。下调miR-3666可消除circ_0008315敲低介导的细胞周期，细胞凋亡以及抗迁移作用。以上结果都说明了circ_0008315通过靶向miR-3666发挥其作用。(补充图S5、S6)
图S5 抑制 miR-3666 可以逆转 circ_0008315 敲除对 GC 细胞增殖的影响
图S6 抑制 miR-3666 可逆转 circ_0008315 敲除对 GC 细胞凋亡和迁移的影响
CPEB4敲低、缺失以及沉默可抑制circ_0008315过表达对癌症细胞增殖的影响，Transwell实验也证实了CPEB4敲低可以抑制circ_0008315过表达增强的侵袭和迁移能力。综上所述，Circ_0008315对GC增殖、迁移和侵袭的促进作用可以通过抑制CPEB4来挽救。(补充图S7、S8)
图S7 敲除 CPEB4 可抑制 circ_0008315 过表达对 GC 细胞增殖的影响
图S8 敲除CPEB4可抑制circ_0008315过表达对GC细胞迁移和侵袭的影响
5. Circ_0008315促进GC在体内的生长和转移
体内研究发现circ_0008315过表达导致肿瘤体积更大、重量更重，还会导致Ki-67, N-cadherin和CPEB4表达水平升高，E-cadherin表达水平下降；而下调circ_0008315则达到相反的结果，说明了circ_0008315促进GC在体内EMT。还发现circ_0008315与miR-3666呈负相关，circ_0008315与肺转移呈正相关。因此，circ_0008315可以促进GC在体内的生长，转移和EMT。(图6)
图6 Circ_0008315促进体内胃癌生长和转移
6. Circ_0008315促进GC细胞对CDDP的抗性
使用收集的胃癌患者组织构建人GC类器官，确定采用对CDDP敏感的类器官#1和对CDPP耐药的类器官#2进行实验。研究发现，两个类器官在用CDPP处理后，其生长形态和数量有显著差异，且circ_0008315和CPEB4在类器官#2中的表达高于类器官#1，而miR-3666的表达水平相反。敲除类器官#2中的circ_0008315后用CDDP治疗，治疗效果明显改善。在CDDP存在的情况下，沉默circ_0008315和敲低circ_0008315导致CDDP耐药细胞的细胞活力降低和耐药细胞成球体积变小。敲低circ_0008315还导致MKN-45/CDDP细胞中干细胞标记物CD133和CD44的表达降低和异种移植物肿瘤的体积变小、重量降低。以上结果说明circ_0008315促进GC细胞对CDDP的抗性。(图7)
图7 Circ_0008315增强GC细胞对CDDP的抗性
7. PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs可以有效抑制GC增殖和顺铂耐药性
采用双乳液溶剂扩散法制备了负载si-circ_0008315#1和亚精胺的聚乙二醇化PLGA NPs，命名为PLGA-PEG (si-circ_0008315#1)NPs。荧光显微镜和LysoTracker Red染色实验表明PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs能增加细胞对药物的摄取，降低溶酶体对药物的清除作用。PLGA-PEG信号主要积累在肝脏和肿瘤部位，说明了纳米材料PLGA-PEG的靶向性。研究人员给予GC-PDX小鼠尾静脉注射PLGA-PEG(si-NC)NPs或PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs后，发现PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs能明显抑制肿瘤的生长，他们还发现PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs对小鼠肝、肾、肺、脾和心脏无明显毒性且PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs能够抑制小鼠异种移植物中circ_0008315的表达。研究人员还发现PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs可以抑制GC生长并逆转CDDP抗性。(图8)
图8 PLGA-PEG(si-circ_0008315#1)NPs在CDPP耐药模型中全身注射的表征和疗效
小结
Circ_0008315通过海绵吸附miR-3666调节CPEB4促进GC发展和顺珀耐药，可将其作为预后预测因子。研究人员还开发出了一个靶向circ_0008315的PLGA-PEG(sicirc_0008315#1)NPs，发现它能有效抑制GC增殖和顺铂耐药性且无明显副作用，因此circ_0008315可能作为一种有前景的GC治疗纳米治疗靶点。
参考文献
Fei Y, Cao D, Li Y, Wang Z, Dong R, Zhu M, Gao P, Wang X, Cai J, Zuo X. Circ_0008315 promotes tumorigenesis and cisplatin resistance and acts as a nanotherapeutic target in gastric cancer. J Nanobiotechnology. 2024 Aug 29;22(1):519. doi: 10.1186/s12951-024-02760-6. PMID: 39210348; PMCID: PMC11360491.
往期推荐
Nature | 首次将血管类器官应用于模拟糖尿病血管病变疾病
心脏类器官项目获省自然攀登立项！最新高分综述全面解析心血管类器官研究进展
Cell Stem Cell | 利用【脊髓类器官】模型，阐明脊髓发育早期微环境对神经再生的作用
重磅推荐！首次建立基于类器官的药敏试验在肿瘤精准医疗和药物开发中的应用共识
突破！利用脑类器官与乳腺癌细胞共培养，体外模拟乳腺癌脑转移机制
IF14+ 创新应用！中山大学一附院团队成功构建人纤毛外翻型鼻类器官，填补气道上皮分化中基质金属蛋白酶作用机制的空白
本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社