中科院王亮生团队转录组+代谢组揭示西北牡丹花瓣色斑的形成原因

牡丹一直是中国的国花，被誉为“花中之王”。西北牡丹是一个特殊的品种群，花瓣上有红紫色的斑点。斑点特征使花的颜色变化丰富，有效地提高了观赏价值。有趣的是，斑点和非斑点的色素在很大程度上是相互独立的。其潜在的分子机制引起了研究者的广泛关注。中国科学院植物研究所王亮生研究员团队在Horticulture Research在线发表了题为“The combination of DNA methylation and positive regulation of anthocyanin biosynthesis by MYB and bHLH transcription factors contributes to the petal blotch formation in Xibei tree peony”的研究论文。该研究通过转录组，代谢组，DNA甲基化研究手段探究了斑块区域与非斑块区花青素差异原因，发现两个R2R3-MYBs是控制花青素早期和晚期生物合成途径的关键转录因子。

1.‘书生捧墨’牡丹花瓣中黄酮类化合物的研究

作者选择花瓣发育的5个阶段对花瓣的斑点区和非斑点区进行类黄酮检测（S1-S5）。其中花青素仅存于斑点区，识别4种明确花青素成分包括，芍药素3- o -葡萄糖苷(Pn3G)、矢车菊素3- o -葡萄糖苷(Cy3G)、芍药素3,5-二- o -葡萄糖苷(Pn3G5G)和矢车菊素3,5-二-葡萄糖苷(Cy3G5G)(图1B)。斑点区与非斑点区均发现黄酮和黄酮醇。非斑点区黄酮含量显著高于斑点区。斑点区花青素丰度在S2开始急剧增加，之后保持稳定甚至略有下降。非斑点区，黄酮类和黄酮醇苷在S2阶段积累显著，从S2到S3阶段迅速增加。

图1花发育过程中花瓣中的类黄酮成分

2. 花青素生物合成基因在斑点中特异性表达

为了研究花青素只在斑点中积累的原因，对斑点和非斑点区域（以 S1、S3 和 S5 的花瓣为样本）进行了 RNA 测序，以确定花瓣色素沉着的候选基因。重点分析参与类黄酮生物合成途径的单基因，尤其是花青素基因，筛选了斑点及非斑点的差异基因进行qPCR验证，结果与转录组数据保持一致。

图2 斑点区和非斑点区黄酮合成通路结构基因表达图谱

3.参与花青素生物合成的MYB转录因子的鉴定

通过转录组数据鉴定出53个R2R3-MYB基因，与拟南芥的87个蛋白构建了系统发生树。两个物种的MYB转录因子聚为23个亚群，14个蛋白隶属于 SG4、SG5、SG6 和 SG7 亚群，与黄酮生物合成有关。除此之外PsMYB12因为报道与类黄酮相关，PsMYB12及其同簇中的2个转录因子被纳入研究范畴，共17条基因，去除掉表达量较低的之后，最终保留12套基因。克隆12条基因全长后发现，在斑点区及非斑点区无差异。随后作者重点研究了结构基因 PrF3H、PrDFR 和 PrANS 的转录调控，以探索它们在斑点区和非斑点区不同表达的原因。

4.PrMYBa1直接结合EBG PrF3H启动子并激活其转录

染色体步移法克隆PrF3H启动子序列 ，使用PlantCARE数据库推定的顺式作用调控元件，发现了MYB结合位点，。PrF3H基因与12条MYB转录因子进行酵母单杂交(Y1H)实验。结果显示，6个PrMYB蛋白与启动子片段结合。使用双荧光素酶(dual-LUC)报告试验验证了它们是否作为转录激活剂在烟叶中起作用。发现六个prmyb中的一个通过作用于PrF3H的启动子激活了报告基因，激活剂命名为PrMYBa1。通过使用有效的Y1H和双luc报告子实验，发现PrMYBa1作用于PrF3H的启动子(图3A-D)。采用电泳迁移率转移法(EMSA)检测PrMYBa1与PrF3H启动子的结合亲和力。证实了PrMYBa1直接结合PrF3H启动子激活其转录。

图3 PrMYBa1结合PrF3H启动子并激活其转录

5.PrMYBa2与PrMYBa1相互作用形成“MM”复合物并增强PrF3H的激活

除了Y1H验证有结果的6个PrMYB外，作者对另外6个PrMYB转录因子进行了双荧光素酶实验，发现PrMYBa2对PrF3H启动子有略微影响。为了确定PrMYBa2的作用，使用了多组分双荧光素酶报告试验来研究其功能，发现双效应器转染的烟草叶片上有很强的信号，使用酵母双杂交(Y2H)实验来评估PrMYBa1和PrMYBa2蛋白之间的相互作用。在酵母细胞中发现PrMYBa2与PrMYBa1相互作用(图4B)。Pull down实验显示，PrMYBa1被PrMYBa2拉下(图4C)。此外，双分子荧光互补(BiFC)实验显示，在烟草叶片细胞核中，PrMYBa2与PrMYBa1相互作用(图4D)。对这两种prmyb进行了共免疫沉淀(Co-IP)测定，证实了PrMYBa1在植物中与PrMYBa2相互作用(图4E)。

图4 PrMYBa2与PrMYBa1相互作用，增强PrF3H的激活

6.PrMYBa3结合晚期合成基因s的PrDFR和PrANS的启动子并直接激活它们的转录

 DFR 和 ANS 是花青素后期生物合成途径中的关键结构基因，被认为是将二氢黄酮醇转化为白花青素，然后合成有色花青素。斑点区和非斑点区色素沉积的差异可能与PrDFR 和PrANS的斑点特异性表达密切相关。作者克隆了PrDFR和PrANS的启动子序列，确定调控的转录因子。Y1H检测结果，我们发现12个prmyb中的6个和5个成员分别与PrDFR和PrANS的启动子结合。双荧光素酶实验显示，这些prmyb中只有一个通过PrDFR和PrANS的启动子激活了报告基因，被命名为PrMYBa3。进一步的EMSA分析证实，PrMYBa3与含有MBS或MRE元素的PrDFR和PrANS的启动子片段结合(图5D和E)。

图5 PrMYBa3于PrDFR和PrANS的启动子结合并激活其转录

7.两个PrbHLHs (PrbHLH1和PrbHLH2)与PrMYBa3相互作用，作为协同因子

先前的研究表明，类黄酮生物合成的花青素分支通常受 MBW（MYB-bHLH-WDR）转录复合物的调控，为了验证PrMYBa3 是单独还是通过蛋白复合物激活 PrDFR 和 PrANS 的表达，作者对书生捧墨花瓣中 bHLH 家族的所有成员进行了系统进化分析。RNA-seq 数据，鉴定出 53 个全长 PrbHLH 基因，连同143 拟南芥来源的bHLH进行系统发育分析。三个 PrbHLHs 与第五亚群（IIIf）的成员聚类，SG5（IIIf）负责植物花青素生物合成的调控。将这三个 PrbHLH 基因命名为 PrbHLH1、PrbHLH2）和 PrbHLH3。酵母单杂和双荧光素酶实验显示，PrbHLH1-3 无法与这些结构基因的启动子结合。Y2H 试验来确认 PrbHLH1-3 和 PrMYBa1-3 之间的关系。PrbHLH1 和 PrbHLH2 与 PrMYBa3 有相互作用。（图 6A）。BiFC 检测进行了验证（图 6B）这个结果。Co-IP 试验显示，PrbHLH1 和 PrbHLH2 与 PrMYBa3 共免疫沉淀（图 6C）。PrMYBa3 在植物体内可能同时与 PrbHLH1 和 PrbHLH2 相互作用。多组分双荧光酶显示，双效应物 PrMYBa3-PrbHLH1 和 PrMYBa3- PrbHLH2 能更有效地激活 LUC（图 6D-G）。矮牵牛瞬时过表达了 PrMYBa3 和 PrMYBa3-PrbHLH1/2 蛋白复合物，结果显示PsMYBa3 可以激活花瓣花青素生物合成。

图6 PrMYBa3与PrbHLH1和PrbHLH2相互作用，通过蛋白复合物激活PrDFR和PrANS的表达

8. PrMYBs和PrbHLHs的过表达促进了烟草花冠花青素的生物合成

为了确认PrMYBa1、PrMYBa3及其共激活子的功能，作者获得了独立过表达PrMYBa1或PrMYBa3的株系，以及同时过表达PrMYBa1 + PrMYBa2或PrMYBa3 + PrbHLH1/2的株系的转基因烟草植株。过表达PrMYBa1-的品系的花冠色素沉着有明显的促进作用。花青素在花冠中的分布不均匀，部分集中或在花冠中形成心形图案。(PrMYBa1 + PrMYBa2)-OE的花冠颜色没有明显增强(图7A和B)。HPLC分析显示，PrMYBa1-OE的总花青素(TA)和总黄酮/黄酮醇(TF)含量远高于(PrMYBa1 + PrMYBa2)-OE(图7D和E)， qRT-PCR结果显示，NtF3H和其他早期合成基因的表达在PrMYBa1-OE中上调，在(PrMYBa1 + PrMYBa2)-OE中显著上调。这些结果表明，PrMYBa1单独或与PrMYBa2联合激活了烟草花中早期合成基因早期生物合成基因的表达，PrMYBa1似乎有助于花青素的生物合成，而PrMYBa2则不促进花青素的产生。PrMYBa3-OE株系在视觉上也与阴性对照不同，花冠显示出更深的色调。色素沉着集中在花瓣的尖端或边缘，有些花甚至呈现出像风车或五角星一样的颜色图案。而T0 (PrMYBa3 + PrbHLH1)-OE和(PrMYBa3 + PrbHLH2)-OE的花冠上色素分布均匀，呈深粉红色。同时过表达PrbHLH1和PrbHLH2的株系的表型表明，它们可能促进了花冠的色素沉着。(图7)。HPLC分析表明，单、双转基因系的总花青素和TF含量均显著提高。当基因同时过表达时，TA增加更多，而TF保持不变(图7D和E)。根据qRT-PCR分析，PrMYBa3和PrMYBa3- prbhlh1或PrMYBa3- prbhlh2复合物显著促进晚期合成基因s NtDFR和NtANS的表达。这些结果表明，PrMYBa3单独或与PrbHLH1和PrbHL2联合激活了烟草花中晚期生物合成基因的表达，PrbHLHs促进了花青素的积累。

图7 转基因烟草植株分析

9.PrF3H和PrANS启动子的DNA甲基化在斑点区和非斑点区存在差异

为了研究斑点区特异性高转录 PrF3H、PrDFR 和 PrANS 的原因，qRT- PCR 分析了上述转录因子基因的表达模式。结果显示，转录因子基因的相对表达水平与结构基因之间没有明显的关系。因此，作者怀疑某些因素会影响这些花青素结构基因在花瓣白色区域的启动子功能。早期研究表明，发生在胞嘧啶（C）碳-5 位的 DNA 甲基化广泛分布于基因组中，并影响基因的表达 。PrF3H、PrDFR 和 PrANS 在斑点区和非斑点区的不同表达可能是其启动子甲基化的结果；因此，作者进行了 DNA 甲基化分析来验证这一猜想。结果表明，PrANSpro在 S2 的紫色区域和白色区域，PS2（-1254 至 -628bp）和 PS3（-711 至 -226bp）区域的甲基化程度有很大差异。然而，PS1（-1576 至 -1103 bp）和 PS4（-311 至 -29 bp）区域的甲基化却没有差异。结果表明，花发育阶段，非斑点区的 PrANS 启动子发生了超甲基化（图 8A 和 B）。PrF3Hpro 分析结果显示，白色区域的 PS1（-964 至 -515bp）甲基化程度较高（图 8C 和 D）。PrANS和PrF3H启动子的DNA甲基化可能与其在花瓣非斑点区的沉默有关，这是调控西北牡丹花瓣色素沉着模式形成的潜在机制。

图8 花瓣紫色和白色区域PrANS和PrF3H启动子胞嘧啶甲基化分析

本研究揭示了与“书生捧墨”牡丹斑块形成密切相关的因素。通过转录组与代谢组关联分析，发现花青素结构基因的沉默阻止了非斑点性色素沉着，其中PrF3H、PrDFR和PrANS是三个主要基因。两个R2R3-MYBs是控制花青素早期和晚期生物合成途径的关键转录因子。PrMYBa1通过与PrMYBa2相互作用形成' MM '复合物，激活早期生物合成基因PrF3H。PrMYBa3与两个 bHLHs相互作用，协同激活后期生物合成基因 PrDFR和PrANS，这是花青素在花瓣斑点中积累所必需的。斑点和非斑点之间PrANS和PrF3H启动子甲基化水平的比较表明，高甲基化与基因沉默相关。在花发育过程中，PrANS启动子的甲基化动力学揭示了潜在的早期去甲基化反应，这可能是PrANS仅在斑点区特异表达的原因。花瓣斑点的形成可能与结构基因启动子的转录激活和DNA甲基化高度相关。