从Matrigel到更多：一种通用ECM包埋类器官模型免疫染色优化方案

本文来源：盛合瑞生物

文章介绍

2024年6月，德国科研团队在期刊STAR Protocols上发表了一篇题为“Protocol for whole-mount immunofluorescence staining of ECM gel-embedded innervated pancreatic organoids”的文章，提出了一种用于凝胶包埋的胰腺类器官的全切片免疫荧光染色的实验方案。

#1

摘要

Abstract

在3D培养中，细胞外基质（ECM）凝胶的强制使用限制了抗体的渗透并增加了背景影响，而移除ECM凝胶又会导致形态学的破坏和样本丢失。这些因素对有效的免疫标记染色带来了挑战。本文提出了一种用于凝胶包埋的胰腺类器官的全切片免疫荧光染色的实验方案，描述了样本固定、封闭和抗体孵育的步骤。

#2

预期结果

Results

类器官等3D培养模型具有包括不同细胞类型以及细胞与细胞、细胞与ECM相互作用的优势。嵌入ECM的3D培养物的可视化对于准确的组织病理学评估非常重要。然而，基于免疫标记的染色对于从事该领域工作的科学家来说是挑战。其局限性主要来自于ECM凝胶的存在。ECM凝胶（与 ECM的浓度有关）会降低抗体的穿透力并引起背景自发荧光。这些问题可以通过清除ECM凝胶来最小化。冷冻切片也是对3D体外模型及其内部结构进行免疫染色的一种替代方法。不过，这两种技术都不可避免地会造成形态破坏。由于去除ECM凝胶，类器官容易聚集，较大的类器官会塌陷，样本也会在清洗步骤中丢失。要保护轴突等固有的脆弱结构几乎是不可能的。冷冻切片会导致组织整体变形，从而限制大范围的体积成像和神经元追踪。本文描述了一种不去除ECM凝胶的神经支配胰腺类器官全切片免疫荧光染色方法。固定方法有所改变，将固定时间缩短为15分钟，使用了2%的稀释PFA。优化固定、改良缓冲液和增加的清洗步骤可减少荧光背景。保留ECM凝胶具有保护神经和类器官形态的优势。通过样本的共聚焦显微镜图像，还可以对胰腺癌的神经可塑性进行更准确的软件研究。该方案针对 Matrigel 包埋的神经支配胰腺类器官进行了优化，预计也适用于其他 ECM 包埋三维培养模型。

神经细胞与类器官共培养7天后，可在共培养的第3天用明视野显微镜观察到神经元形态（图1A）。共培养7天后，神经支配的胰腺类器官可进行固定和全切片染色（图1B）。

图1 共培养中神经支配胰腺类器官的发育过程。共培养第3天的神经元形态(A)相位比，10倍，比例尺:400mm)。共培养第7天，与胰腺类器官结合较好的生长神经元(B)相位比，10倍，比例尺:400mm)。箭头表示两幅图中的神经元(→)

本方案使得通过共聚焦显微镜清晰成像胰腺类器官的神经支配成为可能。神经元投影的完整性得以保留，并且可以看到它们与胰腺类器官的相互作用(图2和3)。此外，可以使用共聚焦显微镜拍摄的几个切片的z堆叠图像进行3D动画和基于3D软件的分析。

图2 神经支配胰腺类器官和Z阶的全切片免疫荧光染色。E-Cadherin阳性（绿色）胰腺类器官位于图像中心。β3-微管蛋白（红色）和GFAP（灰色）阳性神经元位于类器官周围。神经突起保持完整，并向类器官延伸。细胞核用DAPI（蓝色）染色。Z-stack的最大投影图像（A）和每个Z-step的单投影图像（B）（共聚焦显微镜，20倍，Z-step尺寸=2mm，比例尺：400mm）。

图3 胰腺类器官神经支配的全切片免疫荧光染色。β3-微管蛋白阳性的神经元（红色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）（A）被Schwann细胞包围的轴突的GFAP阳性髓磷脂片（灰色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）（B）。E-Cadherin阳性的胰腺类器官（绿色），β3-微管蛋白阳性的神经元（红色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）（C）E-Cadherin阳性的胰腺类器官（绿色），被雪旺细胞包围的轴突的GFAP阳性髓磷脂片（灰色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）（D）（共聚焦显微镜，20倍，比例尺:400mm）。

无神经支配的正常胰腺类器官(来源于单一培养的胰腺类器官)可以作为阴性对照。神经元标记物β3-Tubulin和胶质标记物GFAP应该没有任何信号(图4)。仅用二抗染色的对照应该没有任何荧光信号(图5)。

图4 胰腺非神经支配类器官的全切片免疫荧光染色。无神经支配的正常小鼠胰腺类器官E-Cadherin（绿色）阳性，β3-Tubulin（红色）和GFAP（灰色）阴性（A）（共聚焦显微镜，20倍，比尺:400mm）。

图5 仅用二抗和DAPI控制神经支配胰腺类器官的全切片免疫荧光染色。Alexa Flour 488（绿色）的类器官右上边缘观察到平滑的自身荧光，Alexa Flour 594（灰色）和Alexa Flour 647（红色）（A）观察到少量荧光颗粒（共聚焦显微镜，20倍，比尺:400mm）。

实验

使用该方案对神经支配的胰腺类器官进行全贴壁免疫荧光染色。该方案可保护轴突等固有脆弱结构的形态，也可用于其他3D培养环境。

注：所述溶液用量按8孔培养板的8个孔滑动计算。

培养受神经支配的胰腺类器官

时间：7天

按照已公布的方案在8孔培养板中培养受神经支配的胰腺类器官。

配制原液

时间： 30分钟

1. 配制100mL PBS-甘氨酸（10x）原液。

a. 在100mL螺旋盖实验瓶中加入7.5 g甘氨酸。

b. 加入90mL 10x PBS。

c. 在磁力搅拌器上搅拌溶液，直到得到均匀的溶液。

d. 将pH值调至7.4。

e. 加入10x PBS，使体积达到100mL。

f. 检查pH值是否仍为7.4，如果需要，将pH值调至7.4。

g. 用0.2mm过滤器过滤。

2. 配制100mL IF-洗涤缓冲液（10x）储备液。

a. 在10mL螺旋盖实验瓶中加入0.5 克 NaN3。

关键：NaN3有剧毒。避免直接接触。戴上双层手套，对皮肤有较厚的保护，处理完NaN3后直接脱掉手套。不要忘记佩戴安全眼镜、穿白大褂和密底鞋。

b. 加入1g BSA。

c. 加入80mL 10x PBS。

d. 加入2mL Triton X-100。

e. 加入0.5mL Tween-20。

f. 在磁力搅拌器上搅拌溶液，直到得到均匀的溶液。

g. 将pH值调至7.4。

h. 加入10x PBS，使体积达到100mL。

i. 检查pH值是否仍为7.4，如果需要，将pH值调至7.4。

j. 用0.2mm过滤器过滤。

缓冲液和（1X）溶液的制备

时间：15分钟和2天

3. 配制果糖-甘油透明溶液，代替荧光装片介质，以提高透明度并保留荧光信号。

a. 在100mL螺旋盖实验瓶中加入33mL甘油。

b. 加入7mL ddH2O。

c. 29.72克果糖。

d. 在磁力搅拌器上搅拌。

关键：可能需要2天才能得到不含果糖结晶的均匀溶液。建议在开始染色的当天准备该溶液。

4. 准备4mL 2%的多聚甲醛溶液。

a. 在15mL 锥形管中加入2mL 4%的多聚甲醛溶液和2mL无菌PBS。

b. 将2%多聚甲醛溶液加热至37℃。

关键：多聚甲醛有毒。不要忘记戴手套和安全眼镜。在通风橱下使用多聚甲醛，避免吸入和直接接触。

5. 配制50mL PBS-甘氨酸溶液。

a. 在50mL锥形管中加入5mL PBS-甘氨酸（10x）原液。

b. 用蒸馏水补足至50mL。

c. 将1X PBS甘氨酸溶液加热至37℃。

6. 准备50mL（1x）IF-Wash缓冲液。

a. 在50mL锥形管中加入5mL（10X）IF-Wash缓冲液原液。

b. 用蒸馏水补足至50mL。

c. 将(1X) IF-洗涤缓冲液加热至37℃。

7. 准备温热的工作板，以便在操作过程中为室内载玻片保温。

a. 在T175烧瓶中注入无菌水。

b. 滴入3滴水浴灭菌溶液。

c. 用未经过滤的瓶盖盖上T175烧瓶，并用保鲜膜密封。

d. 在开始任何操作前，将准备好的工作板在 37℃温度下预热。

固定和清洗

时间：1小时40分钟

本步骤说明了样品的固定、清洗样品以清除固定液残留物以及提高渗透性。

关键：由于温度直接影响ECM凝胶的凝固性，因此请始终将载玻片放在预热的工作板上，并在37℃下预热所有缓冲液和溶液。还请轻柔缓慢地执行所有移液步骤。

1. 固定样品。

a. 共培养7天后，吸干8孔中的培养基。

b. 在每个孔中加入500mL预热过的PBS。

c. 吸出PBS，用500mL预热的2% PFA在常温下处理每个孔15分钟。

关键：PFA有毒性。不要忘记戴手套和安全眼镜。在通风橱下使用 PFA，避免吸入和直接接触。

2. 清洗样本以清除固定液残留物。

a. 吸出PFA溶液。

b. 在每个孔中加入500mL预热过的1x PBS-甘氨酸溶液。

c. 在20rpm的水平振荡器上，于RT下清洗样品10分钟。

d. 吸出1x PBS-甘氨酸溶液，再重复步骤2.b和2.c两次（使用1x PBS-甘氨酸共进行3次洗涤）。

暂停： 在进行第3步之前，样品可在1x PBS中于4℃下保存2天。

3. 增加渗透性。

a. 吸出PBS-甘氨酸溶液。

b. 在每个孔中加入500mL预热的1x IF-Wash缓冲液。

c. 将样品在室温下静置20分钟，以增加通透性和抗体渗透性。

d. 吸取旧的1x IF-Wash缓冲液。

e. 在每个孔中加入500mL预热过的1x IF-Wash缓冲液。

f. 继续用预热的1x IF-Wash缓冲液在RT条件下以20rpm的转速水平振荡10分钟。

g. 再重复步骤3.d.，3.e.和3.f两次（使用IF-Wash缓冲液共进行4次洗涤。1次20分钟，3次10分钟）。

阻断和一抗孵育

时间：1小时和2天

该步骤说明了阻断作用，以防止非特异性结合并有效孵育一抗。

关键：由于温度直接影响ECM凝胶的凝固性，因此请始终将载玻片放在预热的工作板上，并在37℃下预热所有缓冲液和溶液。此外，所有移液步骤都要轻柔缓慢地进行。

4. 阻断。

a. 用IF-Wash缓冲液稀释2%的普通山羊血清，配制2.5mL阻断液。

i. 在2.5mL离心管中混合2mL IF-Wash缓冲液和500mL 10%普通山羊血清。

ii. 在37℃水浴中加热封闭液。

注意：根据本研究中所用一抗的特点，使用普通山羊血清进行封闭。请参考一抗生产商的建议。在选择合适的封闭液时，二抗培养物的血清也是一个不错的选择。

b. 吸出孔中的IF-Wash缓冲液。

c. 在每个孔中加入50mL在步骤3.a.中配制的2%阻断液，室温下处理样品1小时。

5. 在用封闭液处理样品的同时，用IF-Wash缓冲液按1:250的比例稀释一抗，制备一抗混合物。

注意：每孔需要300mL一抗混合物。建议为整个8孔培养板准备2.5mL抗体混合物。

a. 在2.5 mL离心管中混合10mL一抗（如下表1所列）和2470mL IF-Wash缓冲液。

关键：所述抗体组合以相同浓度（1-250）使用，以优化纯化小鼠抗E-钙粘蛋白、多克隆兔神经纤维酸性蛋白（GFAP）和鸡多克隆b3-微管蛋白的三重染色。如果使用其他组合，请不要忘记选择不同宿主的一抗并优化抗体浓度。

注意：建议只用二抗对照染色，以获得更可靠的染色效果。样品的一孔应注入300mLIF-Wash缓冲液，然后在整个过程的其余部分与其他孔一样使用。

表1

6. 孵育1小时后，移去阻断液，在每个孔中加入300m 一抗混合物。

a. 盖上盖玻片，用保鲜膜密封以防蒸发。

b. 在4℃下孵育2天。

清洗和二抗孵育

时间：1小时30分钟和1天

此步骤说明如何清除一抗残留物并有效孵育二抗。

关键：由于温度会直接影响ECM凝胶的凝固性，因此在操作过程中，请始终将载玻片放在预热的工作板上，并在开始使用前将所有缓冲液和溶液预热至37℃ 。此外，在执行所有移液步骤时，请轻柔缓慢。

7. 从冰箱中取出样品，在室温下放置至少1小时，以使ECM凝胶更加稳定。

关键：在进一步使用之前，将样品置于室温下加热以获得更稳定的ECM凝胶是非常重要的。否则，样品很容易在洗涤步骤中丢失。

8. 吸出孔中的一抗混合物。

a. 在每个孔中加入500mL预热过的1x IF-Wash缓冲液。

b. 用预热好的1x IF-Wash缓冲液在RT条件下以20rpm的转速水平振荡10分钟。

c. 吸出旧的1x IF-Wash缓冲液。

d. 在每个孔中加入500mL预热过的1x IF-Wash缓冲液。

e. 用预热的1x IF-Wash缓冲液在RT条件下以20rpm水平振荡器继续洗涤10分钟。

f. 再重复一次步骤8.c.、8.d.和8.e.。

9. 用IF-Wash缓冲液按1 ：500的比例稀释二抗（如下表2所列），制备二抗混合物。

注意：每孔需要300mL二抗混合物。建议为整个8孔培养板制备2.5mL抗体混合物。

a. 在2.5mL离心管中混合5mL二抗、2.5mL用于核染色的DAPI和2482.5mL IF-Wash缓冲液。

关键：所给的二抗组合和浓度是根据本实验所选一抗的特点优化的。如果改变一抗组合，应尝试其他方案。

10. 吸出孔中的IF-Wash缓冲液，在每个孔中加入300mL的二抗混合物。

11. 在4℃下孵育样品 24 小时。

表2

清洗和装片

时间：2小时45分钟

最后一步包括过度清洗步骤，以彻底清除二抗残留物，并用果糖-甘油清除溶液固定样品，使样品更加透明。

关键：由于温度直接影响ECM凝胶的凝固性，因此在操作过程中，请始终将载玻片放在预热的工作板上，并在开始使用前将所有缓冲液和溶液预热至 37℃。此外，在执行所有移液步骤时，请轻柔缓慢。

12. 将样品从冰箱中取出，在室温下放置至少1小时，以使ECM凝胶更加稳定。

关键：在进一步应用之前，将样品置于室温下以获得更稳定的ECM凝胶是非常重要的。否则，样品很容易在清洗步骤中丢失。

13. 用1x IF-Wash缓冲液清洗样品。

a. 吸出孔中的二抗混合物。

b. 在每个孔中加入500mL预热过的1x IF-Wash缓冲液。

c. 用预热的1x IF-Wash缓冲液处理样品30分钟，在RT条件下以20rpm的转速水平摇动。

d. 吸取旧的1x IF-Wash缓冲液。

e. 在每个孔中加入500mL预热过的1x IF-Wash缓冲液。

f. 用预热的1x IF-Wash缓冲液在RT条件下以20rp 的转速水平振荡20分钟。

g. 再重复步骤9.c.、9.d.和9.e.两次（使用1x IF-Wash缓冲液完全洗涤4次。1次30分钟，3次20分钟）。

14. 用 1x PBS 缓冲液清洗样品。

a. 吸出孔中的IF-Wash缓冲液。

b. 在每个孔中加入500mL预热过的1x PBS。

c. 用预热过的1x PBS缓冲液处理样品20分钟，在RT条件下以20rpm的转速水平摇动。

d. 吸取旧的1x PBS。

e. 在每个孔中加入500mL预热过的1x PBS。

f. 用预热的1x PBS缓冲液在RT条件下以20rpm的转速水平摇动20分钟，继续清洗步骤。

g. 再重复10.d.、10.e.和10.f.步骤两次（总共用1x PBS洗涤4次）。

15. 用果糖-甘油溶液固定样品。

a. 吸干孔中的PBS。

b. 加入50-100mL果糖-甘油清洗液，直至样品完全被果糖-甘油清洗液覆盖。

关键：果糖-甘油清洗液是半粘稠的，可能会产生气泡。将果糖-甘油清洗液加热至37℃，并使用塑料巴斯德移液管转移，有助于减少气泡。

c. 样品在4℃下保存24小时后即可成像。

注意：样品可在4℃下保存4周，在-20℃下保存数月。冷冻样品可在37℃解冻，以减少结晶可能造成的影响。

材料

故障排除

参考文献

Beşikcioğlu HE, Yurteri Ü, Ye L, Zhang F, Moretti A, Gürcinar IH, Dogruöz A, Karakas D, Friess H, Ceyhan GO, Istvanffy R, Ekin Demir I. Protocol for whole-mount immunofluorescence staining of ECM gel-embedded innervated pancreatic organoids. STAR Protoc. 2024 Jun 13;5(2):103132. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103132. Epub ahead of print. PMID: 38875112.

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本文来源：盛合瑞生物