单细胞测序与多组学分析首次提出周围神经再生前血管龛理论！

Netrin-1（NTN1）是一种轴突导向分子，它在周围神经损伤后表达上调，并可能在血管龛的形成中扮演重要角色。此外，外泌体作为细胞间通讯的媒介，已被发现在促进血管生成、轴突再生和功能恢复中发挥作用。因此，对周围神经损伤后血管龛形成机制的深入理解，以及开发新的治疗策略来促进神经再生变得十分重要。

6月28日，郑州大学第一附属医院骨科周南副教授团队，吉林大学第一医院王元一副教授团队和郑州大学第一附属医院急诊科杨宁宁医师团队在国际权威期刊Science Advances在线发表了题为“Netrin-1–engineered endothelial cell EXOsomes induce the formation of pre-regenerative niche to accelerate peripheral nerve repair”的论文，郑州大学第一附属医院骨科黄金生硕士和李江南博士为该论文的共同第一作者。

欧易生物为本研究单细胞测序及分析提供了技术支持。

发表期刊：Science Advances

影响因子：11.7

涉及的欧易生物服务产品：单细胞转录组测序

尽管成年哺乳动物周围神经系统（PNS）具有一定的自我修复能力，但其再生过程涉及的多种细胞类型如何协调工作的具体机制尚不清楚。特别是，血管龛的形成在神经损伤后的早期阶段对再生至关重要，但目前对血管龛如何调控神经修复的了解还不够充分。

该文章研究了Netrin-1（NTN1）工程化的内皮细胞外泌体（NTN1 EC-EXO）在促进周围神经损伤（PNI）修复中的作用。研究团队首先探讨了血管龛在PNS再生中的重要性，并发现NTN1在神经损伤后上调表达，可能对血管龛有调节作用。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和多组学分析，研究者揭示了高表达NTN1的内皮细胞（NTN1+ECs）及其衍生的外泌体在血管生成、轴突再生和雪旺细胞修复表型中的关键作用，表明NTN1 EC-EXO作为一种潜在的治疗策略，对于PNI的治疗具有重要意义。

1. 在PNI后，损伤部位NTN1的上调和血管龛的形成

为了在早期损伤后可视化血管龛的形成和NTN1在神经损伤部位的变化，作者结合了CUBIC组织透明化技术，四重免疫荧光染色以及光片全神经成像技术来观察损伤神经中的血管龛形成情况（图1A）。在损伤部位可以看到以新形成的血管和NTN1上调为特征的血管龛（图1B和C）。通过免疫染色和共聚焦显微镜对神经横截面和纵切面的观察，进一步描绘了血管龛的解剖特征（图1D）。

图1 PNI后在损伤部位形成与NTN1相关的血管微环境

2. 通过scRNA-seq绘制大鼠损伤坐骨神经图谱，揭示了NTN1+ECs在促进血管生成，神经修复和细胞通讯间的作用

作者在大鼠坐骨神经受损后进行了3天和7天损伤后的scRNA-seq，使用未损伤的神经作为假手术对照。UMAP图可视化了正常和损伤神经在不同时间点的细胞簇和比例（图2A至C）。UMAP揭示了正常和受损神经中NTN1+ECs的分布（图2E）。KEGG富集分析揭示了NTN1+ECs上调的与神经修复和血管生成相关的途径（图2F）。GO富集分析显示细胞外间隙和细胞外基质的表达上调（图2G）。CellChat分析表明，NTN1+ECs作为配体和受体建立了更多的VEGF介导的细胞间连接（图2J和K）。

图2 scRNA-seq揭示了NTN1+ECs在血管龛形成中的显著作用

3. NTN1在体外增强血管生成并调节ECs中与血管生成相关的信号通路

为了验证NTN1对EC血管生成相关表型的体外作用，作者使用慢病毒载体构建过表达NTN1的ECs（图3A至C）。结果显示NTN1过表达提高了EC增殖能力（图3D至H），血管生成能力（图3I和K），S期细胞数量（图3J和L）和细胞迁移能力（图3M至Q）。韦恩图显示了两组之间的差异表达基因（DEGs）数量和富集通路（图3R至U）。

图3 NTN1增强并维持ECs中的血管生成相关表型

4. NTN1 EC-EXO诱导的促再生表型和促再生表型相关的通路富集

作者对从LV-NC组（EC-EXO）和LV-NTN1组（NTN1 EC-EXO）的ECs衍生的外泌体进行分离和表征（图4A至C）。结果显示，NTN1在NTN1 EC-EXO中的表达显著上调（图4D）。作者使用RNA-seq来分析NTN1 EC-EXO处理的PC12细胞中转录组发生的变化，发现DEGs主要富集在与促再生表型相关的通路中（图4N）。基因集富集分析（GSEA）显示 NTN1 EC-EXO 处理可能有助于激活促进血管生成、轴突再生和细胞粘附的信号通路（图4O）。作者接着进行了实验验证，结果表明 NTN1 EC-EXO 提高了NTN1的表达以及mTOR、AKT和ERK1/2的磷酸化（图4P）。

图4 NTN1+ECs来源EXO诱导的促再生表型和转录组谱

5. NTN1 EC-EXO通过let7a-5p的下调促进PC12细胞的促再生表型

作者使用miRNA测序分析了用NTN1 EC-EXO和EC-EXO处理的PC12细胞的表达谱（图5A），分析发现与促再生表型调节相关的信号传导途径上调（图5B）。此外，发现 let7a-5p在NTN1 EC-EXO 组下调（图5C）。进一步实验结果表明，let7a-5p的过表达显著抑制了PC12细胞的增殖能力，集落形成能力和迁移能力（图5 E至G和图5 J至M），同时增加了PC12细胞S期细胞数（图5H和I）并降低了轴突长度（图5N和O）。结果表明let7a-5p作为NTN1表达和 mTOR、AKT、ERK1/2 磷酸化的负调控分子（图5P）。

图5 NTN1 EC-EXO通过let7a-5p的下调促进PC12细胞的促再生表型

6. 多组学分析揭示了NTN1 EC-EXO诱导的促再生血管龛的分子机制

作者在EC-EXO和NTN1 EC-EXO上应用了miRNA测序和蛋白质组学技术（图6A）。通路富集分析揭示了与细胞粘附和轴突生长相关的重要通路（图6B至D），let7a-5p的表达在NTN1 EC-EXO中下调（图6E至G）。作者从富集途径中筛选了显著的基因，显示了介质和途径之间的相互作用关系（图6K和L）。同时，作者完成了基于外泌体多组学数据的通路层面整合。在EC-EXO和NTN1 EC-EXO中，786个重叠的KEGG/Reactome通路在蛋白质组和miRNAs的基因靶标中富集（图6P），它们可能在NTN1 EC-EXO诱导的促再生血管龛形成中发挥重要作用。

图6 EXOs的多组学分析揭示NTN1 EC-EXO诱导的促再生血管龛相关分子机制

7. NTN1 EC-EXO在神经中的分布及对损伤神经的神经修复作用

作者为了观察NTN1 EC-EXO在坐骨神经中的分布，将DiR标记的NTN1 EC-EXO和EC-EXO注射到大鼠坐骨神经的背侧，然后在注射后的1、3、7、14 和 21天进行体内成像。成像结果表明EC-EXO和NTN1 EC-EXO在神经中分布良好且持续时间较长（图7A和B）。NTN1 EC-EXO主要分布在整个神经中，表明它们具有更好的神经元亲和性（图 7 C和D）。实验结果表明，NTN1 EC-EXO治疗具有最佳的神经修复效率。

图7 NTN1 EC-EXO在神经中的分布及损伤神经的组织学改变

8. NTN1 EC-EXO增强受损神经的血管生成、轴突再生和髓鞘化

坐骨神经的四重免疫荧光染色结果表明，NTN1 EC-EXO在早期阶段损伤部位的NTN1表达上调（图8A）。NTN1 EC-EXO组在术后14天开始显示出轴突和髓鞘再生能力的显著增强（图8B）。NTN1 EC-EXO显著增加了S期的细胞计数（图8C和D）。此外，用NTN1 EC-EXO处理的受损神经显示出CD31和Ki67的表达增强和CD31+Ki67+细胞的比例增加（图8I和J）。

图8 NTN1 EC-EXO促进PNI后的血管生成和神经修复

9. NTN1 EC-EXO促进受损神经的神经支配

示意图显示获取大鼠足迹图像的方法（图9A）。如图9B所示，假手术组和NTN1 EC-EXO组的大鼠足迹清晰且展开，而PNI组发展出严重的足部挛缩。NTN1 EC-EXO组的SFI值显著高 EC-EXO和PNI组（图 9C）。NTN1 EC-EXO组受损侧的复合肌肉动作电位（CMAP） 幅度高于EC-EXO和PNI组（图9D至F），并显示出更低的撤回阈值（图 9G和H），同时NTN1 EC-EXO组的腓肠肌更大（图9I和J），肌纤维平均直径大于EC-EXO组和PNI组（图9K和L）。

图9 用NTN1 EC-EXO处理的PNI大鼠的神经支配研究

通过scRNA-seq和多组学分析，本研究揭示了NTN1 EC-EXO在形成周围神经再生前血管龛中的关键作用，这一血管龛通过激活聚焦粘附、轴突导向、PI3K-AKT和mTOR信号途径来促进血管生成和轴突再生。通过体外实验和体内实验，研究团队观察到NTN1 EC-EXO能够改善神经再生、增加血管生成、促进轴突再生和再髓鞘化。此外，NTN1 EC-EXO在体内显示出良好的神经亲和性，并且在早期阶段对神经修复和功能恢复具有显著的促进作用。

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